מידול סרטן הערמונית במודלים של עכברים מהונדסים גנטית: טכניקת עריכת גנים מקומית בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי האונה הקדמית של הערמונית בעכבר

Abstract

מקור: Riedel, M. et al. העברת וירוסים של מדריכי CRISPR לערמונית מורין לשינוי גנים. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מתאר שיטה לעריכת גנים ספציפיים בתאי בלוטת הערמונית באמצעות מערכת העברה מבוססת אדנווירוס. הגישה מאפשרת שינוי אורתוטופי ומקומי של ביטוי גנים תוך שימוש בטכנולוגיית CRISPR לפיתוח מודלים עכבריים חדשניים לסרטן הערמונית.

Protocol

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. משלוח וירוסים לערמונית מורין

1. מרדימים את בעל החיים על ידי הזרקה intraperitoneal עם מזרק סטרילי 1 מ"ל ומחט 27G x 1/2 ". יש להשתמש במינון הרדמה של 0.01 מ"ל/גרם משקל גוף. אם ההליך נמשך יותר מ -30 דקות, לשמור על הרדמה על ידי הזרקת 1/3 של המינון ההתחלתי כל 30 דקות.
2. בחן את עומק ההרדמה על ידי הערכת הרפיית שרירים, נסיגה מדוושה ורפלקסים מישושיים. כאשר אובדן רפלקסים הוא ציין, לגלח את הבטן התחתונה של החיה.
3. בזהירות לכסות את העיניים של החיה עם משחה וטרינרית אופתלמית באמצעות צמר גפן סטרילי כדי למנוע עיוורון עקב חוסר רפלקס הקרנית.
4. נגבו את הבטן המגולחת ב-70% אתנול ו-10% פובידון-יוד לחיטוי אזור הניתוח. יש לקרצף את אזור הניתוח ממרכז אזור הניתוח לכיוון הפריפריה.
5. יש לבצע חתך עור אנכי בקו האמצע של הבטן התחתונה של כ-1 ס"מ באמצעות מספריים כירורגיים סטריליים.
6. הרימו את הצפק באמצעות מלקחיים נקודתיים עדינים כדי למנוע פגיעה באיברים השוכבים מתחת. בזהירות לבצע חתך <8 מ"מ באמצעות מספריים כירורגיים דרך הצפק.
   הערה: בניגוד לבני אדם, בלוטת הערמונית של מכרסם מורכבת מארבע אונות נפרדות. האונה הקדמית מחוברת לשלפוחית הזרע.
7. הזיזו בעדינות את רקמת השומן הצידה כדי לחשוף את שלפוחית הזרע. באמצעות מלקחיים טבעתיים, הרימו בזהירות את שלפוחית הזרע עד שניתן יהיה לזהות את הערמונית הקדמית (איור 1).
8. הזריקו נפח כולל של וירוס 30 μL (3 x 10¹⁰ חלקיקים נגיפיים) באפיתל הערמונית הקדמי באמצעות מזרק אינסולין 0.5 מ"ל עם מחט 30G x 8 מ"מ. צמצמו את הדליפה וודאו שהנוזל נספג בתוך הרקמה ויוצר בועה קטנה. הניחו את שלפוחית הזרע בחזרה בחלל הבטן.
9. תפרו את הצפק עם 2-3 תפרים פשוטים קטועים באמצעות 6-0 תפרים נספגים עם 13 מ"מ, 3/8 עיגול, ומחט נקודה מחודדת.
10. הדקו את העור עם שלושה קליפסים סטריליים בגודל 4.8 x 6.5 מ"מ המרימים את העור במלקחיים כדי למנוע פגיעה בצפק.
11. להתאוששות טובה יותר, יש למרוח את תרופת ההרדמה במינון של 0.01 מ"ל/גרם משקל גוף על ידי הזרקה תוך צפקית באמצעות מזרק סטרילי של 1 מ"ל ומחט בגודל 27 גרם x 1/2 אינץ'. החזירו בזהירות את בעל החיים לכלוב שלו.

Results

איור 1: המחשה של ההליך. ההליך מתבצע בעכבר Rosa26-LSL-Cas9-EGFP שנוצר על ידי Platt et al. הערמונית הקדמית (AP) מחוברת לשלפוחית הזרע (SV). חלקיקי וירוסים המבטאים RNA מנחה וחלבון Cre מוזרקים לערמונית הקדמית כדי לשנות את ביטוי הגנים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-cas9*,-} ^{EGFP)Fezh} /J עכברים	מעבדת ג'קסון	26175
0.5 מ"ל מזרק אינסולין U-100	ב.ד.	324825	להזרקת וירוסים
1 מ"ל מזרק	ב.ד.	300013	להזרקת הרדמה
מחט 30 גרם 1/2 אינץ'	ב.ד.	304000	להזרקת הרדמה
6-0 תפר פוליסורב	מדטרוניק	GL889	כדי לסגור את הצפק
וילון ניתוח מעוקר חד פעמי	ספקים מרובים
כרית חימום	ספקים מרובים
פד הכנה פובידון-יוד	פישר סיינטיפיק	06-669-70
מכונת זמירה	אסקולאפ	GT415	כדי לגלח את הבטן
מלקחיים Dumont	פ.ס.ט	11252-00
מחזיק מחט מיקרו Halsey	פ.ס.ט	12500-12
מספריים של איריס	פ.ס.ט	14094-11
מלקחיים בעלי תבנית צרה	פ.ס.ט	11002-12
טבעת מלקחיים	פ.ס.ט	11106-09
ידית מערכת קליפס לפצע כולל קליפים	פ.ס.ט	12030-01	כדי לסגור את העור
מסיר מערכת קליפ לפצע	פ.ס.ט	12030-04
1x PBS	גיבקו	10010-023
אנטיסדאן			מתקבל ממתקן בעלי החיים
בוטורפנול			מתקבל ממתקן בעלי החיים
Medetomidinhydrochlorid			מתקבל ממתקן בעלי החיים
מידזולאם			מתקבל ממתקן בעלי החיים
100% אתנול	פישר סיינטיפיק	22-032-103
משחת עיניים	טקדה	7242
וירוס (AAV, AV)	ספקים מרובים		וירוס המשמש בפרוטוקול זה הוא ייצור פנימי