המרת ביסולפיט של DNA גנומי: שיטה לחקר מתילציה של DNA בדגימות DNA גנומיות מרקמת סרטן מערכת העיכול

תקציר

מקור: Bonetto, A. et al. עכבר נושא גידולי קרצינומה של המעי הגס-26 כמודל לחקר סרטן Cachexia. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את הליך שינוי ביסולפיט של DNA גנומי מדגימות סרטן מערכת העיכול. הטכניקה מועילה לחקר הקשר בין דפוסי המתילציה של גנים וביסוס תרומתם לסרטן.

פרוטוקול

1. טיפול ביסולפיט

1. השתמש 45 μL של תמיסת רקמה מעוכל כמו הדגימה.
2. ביצוע הטיפול בביסולפיט באמצעות ריאגנטים בערכת המרה ביסולפיט בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
   1. הוסף 5 μL של חיץ דילול לדגימת ה- DNA ודגור ב- 37 ° C למשך 15 דקות (ראה טבלת חומרים).
   2. בזמן הדגירה, הכינו את מגיב ההמרה ביסולפיט על ידי הוספת 750 μL של dH₂O ו-210 μL של חיץ דילול לצינור אחד של מגיב המרת CT (ראה טבלת חומרים). מערבבים את הצינורות על ידי ערבול במשך 10 דקות.
   3. לאחר הדגירה של 15 דקות, מוסיפים 100 μL של מגיב המרת CT מוכן לכל דגימה ומערבבים על ידי היפוך.
   4. לדגור על הדגימות בחושך ב 50 ° C במשך 12 עד 16 שעות.
   5. לאחר הדגירה, להסיר את הדגימות ולהניח אותם על קרח במשך 10 דקות.
   6. הוסף 400 μL של חיץ קשירה וערבב כל דגימה על ידי פיפטציה למעלה ולמטה (ראה טבלת חומרים). טען כל דגימה לעמודת ספין ומקם את העמודה בצינור איסוף של 2 מ"ל (ראה טבלת חומרים).
   7. צנטריפוגו כל דגימה במהירות מלאה (10,000 x גרם) למשך דקה אחת והשליכו את הזרימה.
   8. הוסף 200 μL של חיץ כביסה לכל עמודה וסובב במלוא המהירות במשך דקה אחת, תוך השלכת הזרימה (ראה טבלת חומרים).
   9. הוסף 200 μL של חיץ desulfonation לכל עמוד ולאפשר לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות (ראה טבלה של חומרים). לאחר הדגירה, סובבו את העמודים במלוא המהירות למשך דקה אחת והשליכו את הזרימה.
   10. הוסף 200 μL של חיץ כביסה לכל עמוד וסובב במהירות מלאה במשך דקה אחת (ראה טבלת חומרים).
   11. חזור על שלב זה פעם נוספת.
   12. הוסף 46 μL של dH₂O לכל עמודה ומקם כל עמודה בצינור פוליפרופילן חד-פעמי סטרילי חדש בנפח 1.5 מ"ל (ראה טבלת חומרים). סובב כל צינור במשך 2 דקות כדי לנטרל את ה- DNA.
3. הסר כל עמודת ספין מצינור הפוליפרופילן החד-פעמי והשלך (ראה טבלת חומרים). הדנ"א מוכן כעת לניתוח.

2. PCR כמותי ספציפי למתילציה (qMSP)

1. השתמש ב- DNA ששונה על ידי ביסולפיט משלב 1.3 כתבנית עבור PCR בזמן אמת מבוסס פלואורסצנטיות ב- qMSP כדי להעריך מתילציה של האזור המקדם בכל ניתוח גנים.
2. בצע qMSP באמצעות מכשיר PCR בזמן אמת של 96 בארות (ראה טבלת חומרים).
   1. בדוק את מצב המתילציה של המקדם של גן המטרה על ה- DNA שעבר שינוי ביסולפיט באמצעות פריימר קדמי של 200 ננומטר, פריימר הפוך של 200 ננומטר ובדיקות של 80 ננומטר. הכן את תערובת האב עם 16.6 mM (NH₄)₂SO₄, 67 mM Tris pH 8.8, 10 mM β-mercaptoethanol, 10 nM fluorescein, 0.166 mM של כל deoxynucleotide triphosphate, ו 0.04 U/μl של DNA פולימראז (ראה טבלה של חומרים). נפח התגובה הסופי בכל באר עבור כל הבדיקות הוא 25 μL.
   2. בצע מחזור של qMSP באופן הבא: 95 ° C במשך 5 דקות, ואחריו 55 מחזורים של 95 ° C במשך 15 שניות, 60 ° C במשך דקה אחת, ו 72 ° C עבור 1 min.
      הערה: יש לבחור את גן היעד על סמך הקריטריונים של ערכי בטא גדולים יותר, להיות קשור לאיי CpG באזור המקדם, ולהיות מתאים לפריימר ועיצוב בדיקה עבור qMSP.
3. השתמש בגנומי אנושי שטופל ב- CpG Methylase (M.SssI) כבקרת מתילציה חיובית (ראה טבלת חומרים).
   הערה: הכימות הסופי של מתילציה מוגדר כערך המתילציה היחסי (RMV) ומחושב ^כ-2-ΔΔCt עבור כל העתק של זיהוי מתילציה בהשוואה לממוצע Ct עבור β-Actin (ACTB). רצפי פריימר ובדיקה מוצגים בטבלה 1. Ct של 100 משמש עבור עותקים משוכפלים שלא זוהו, אשר נותן ערך של ^2-ΔΔCt קרוב לאפס. נעשה שימוש בנוסחה הבאה:
   ממוצע 2^–ΔΔCt (RMV) = (2^–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2^–ΔΔ Ct_replicate_2 + 2^–ΔΔ Ct_replicate_3)/3.

TT

גן	קדימה 5' - 3'	הפוך 5' - 3'	בדיקה
בי-אקטין	תג GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT	AAC ACA CAA TAA CAA ACA CAA ATT CAC	\56-FAM\ TGT GGG GTG \ZEN\ GTG ATG GAG GAG GTT TAG \3IABkFQ\
EPB41L3	GGG ATA GTG GGG TTG ACG C	ATA AAA ATC CCG ACG AAC GA	AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
(NH4)2SO4	סיגמא-אולדריץ'	14148
10% נתרן דודציל סולפט (SDS)	351-032-721 EA
100% אתנול	סיגמא-אולדריץ'	24194
מערכת PCR בזמן אמת ABI StepOnePlus	אפלייד ביוסיסטמס	4376600	מכשיר PCR בזמן אמת 96 בארות
מגיב המרת CT	מחקר זימו	D5001-1
דאוקסינוקלאוטיד טריפוספט (dNTP)	Invitrogen	10297-018
מים שטופלו ב-DEPC	מים שטופלו ב-DEPC	351-068-131
חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA)	קורנינג	46-034-CL
ערכת מתילציה של EZ DNA	מחקר זימו	D5002
דנ"א גנומי אנושי	מעבדות ביו של ניו אינגלנד	N4002S
בדיקת Infinium Human Methylation 450	אילומינה	WG-314	פלטפורמת מערך להערכה מורכבת של מתילציה של DNA להערכת מצב המתילציה של >450,000 אתרי CpG בגנום
מחזור אור 480	רוש	5015278001
מאגר כריכת M	מחקר זימו	D5002-3
M-Desulphonation Buffer	מחקר זימו	D5002-5
M-Dilution Buffer	מחקר זימו	D5002-2
M-Wash Buffer	מחקר זימו	D5002-4
פרוטאינאז K	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	P8107S
צינור פוליפרופילן חד-פעמי (Eppendorf)	אפנדורף	24533495
טריס הידרוכלוריד (Tris-HCL) 2 M pH 8.8	איכות ביולוגית	351-092-101
Zymo ספין 1 עמודה	מחקר זימו	C1003
β-מרקפטואתנול	סיגמא-אולדריץ'	M3148
פלואורסצאין	ביו-ראד	#1708780
פלטינום Taq פולימראז	תרמופישר סיינטיפיק	10966-034