שימור בהקפאה מבוסס ויטריפיקציה: טכניקת קירור מהירה במיוחד לשימור דגימות ביולוגיות בטמפרטורות נמוכות מאוד לאחסון לטווח ארוך

תקציר

מקור: Lu, J. H. et al. הקמת מודלים של Xenograft שמקורם בסרטן קיבה וקווי תאים ראשוניים. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה, אנו מדגימים שיטת ויטריפיקציה קריוגרפית מהירה במיוחד לשימור דגימות ביולוגיות. השיטה כוללת שימוש בשילוב של cryoprotectants כדי להגן על הרקמה הביולוגית מפני נזקי קיפאון על ידי מניעת היווצרות גבישי קרח תוך תאיים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. שימור רקמות בהקפאה

הערה: חלק זה מתייחס בעיקר לשיטות עבור ערכת הרקמות החיות Cryo Kit. הערכות והציוד העיקריים מפורטים בטבלת החומרים.

1. הרדימו את העכברים בשיטה שאושרה על ידי IRB כאשר קוטר הגידול גדול מ-10 מ"מ.
2. בעזרת מלקחיים ומספריים סטריליים, בודדו לאט לאט את הגידול מהעכברים.
3. לשטוף את רקמות הגידול עם DPBS בצלחת 10 ס"מ. לנתח ולהסיר אזורים נמקיים, רקמת שומן, קרישי דם ורקמת חיבור עם מלקחיים ומספריים.
4. חותכים את רקמות הגידול לעובי מקסימלי של 1 מ"מ עם תבנית.
5. שטפו את הפרוסות עם DPBS בכלי בקוטר 10 ס"מ.< /> הערה: תהליך הוויטריפיקציה כולל שימוש בצינורות המסומנים V1/V2/V3 בשלבים 1.6-1.8. המרכיבים העיקריים הם DMSO וסוכרוז.
6. מעבירים את הפרוסות לצינור V1 בעזרת מלקחיים ודגרים על הצינור ב-4°C למשך 4 דקות. מגלגלים והופכים את הצינור לזמן קצר, ומניחים על 4°C למשך 4 דקות נוספות.
7. יוצקים את תמיסת ה-V1 ופורסים לצלחת בקוטר 10 ס"מ. מעבירים את הפרוסות לצינור V2 בעזרת מלקחיים, ודגרים על צינור V2 בטמפרטורה של 4°C למשך 4 דקות. מגלגלים והופכים את הצינור לזמן קצר, ומניחים אותו על 4°C למשך 4 דקות נוספות.
8. יוצקים את תמיסת V2 ופורסים לתבנית בקוטר 10 ס"מ. מעבירים את הפרוסות לתוך צינור V3 עם מלקחיים, ודגרים על הצינור ב 4 ° C במשך 5 דקות. גלגלו והפכו את הצינור לזמן קצר, והניחו אותו על 4°C למשך 5 דקות לפחות. מוודאים שכל הפרוסות שוקעות בתחתית הצינור.
   1. אם מספר פרוסות נשארות צפות, גלגלו והפכו את הצינור לזמן קצר, והניחו את הצינור שוב על 4°C עד שכל הפרוסות שוקעות לחלוטין; במידת הצורך, השליכו את הפרוסות הצפות.
9. יוצקים את תמיסת ה-V3 ופורסים לתבנית בקוטר 10 ס"מ.
10. חותכים את מחזיקי הרקמה לאורך הנכון ומניחים אותם על גזה סטרילית. מעבירים את הפרוסות למחזיקים. עוטפים את המחזיקים בגזה ומניחים אותם בחנקן נוזלי באמצעות מלקחיים, ולאחר מכן דגירה במשך 5 דקות.
11. תייגו את הבקבוקונים הקריוגניים עם מידע הרקמות.
12. מעבירים את המחזיקים עם פרוסות רקמה לבקבוקונים קריוגניים, המאוחסנים בחנקן נוזלי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת רקמות חיות ערכת Cryo	Celliver Biotechnology, Shanghai, סין	LT2601
תבניות מעובדות רקמות ולהבי עזר	Celliver Biotechnology, Shanghai, סין	LT2603
DPBS	Basalmedia Technology, שנגחאי, סין	L40601