בידוד נויטרופילים בצפיפות נמוכה בצפק: טכניקה להשגת נויטרופילים בצפיפות נמוכה מנוזל שטיפת הצפק באמצעות מיון תאים מופעלים מגנטיים

תקציר

מקור: Kanamaru, R. et al. מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים הנוצרות על ידי נויטרופילים בצפיפות נמוכה המתקבלות מנוזל שטיפת הצפק מתווכות צמיחה והתקשרות של תאי גידול. J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה, אנו מתארים את ההליך לבידוד נויטרופילים בצפיפות נמוכה, או LDN, מנוזל שטיפת הצפק של מטופל אנושי לאחר הניתוח. כך ניתן להשתמש ב- LDNs המתקבלים בניסויים נוספים במורד הזרם כדי להבין את תפקידם בצמיחת הגידול והתקדמותו.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. בידוד LDN משטיפות חלל הבטן

1. רכישה לדוגמה
   1. להחדיר 1,000 מ"ל של מי מלח סטריליים רגילים ישירות לחלל הבטן לפני סגירת הפצע בחולים שעברו ניתוח בטן עקב ממאירות במערכת העיכול.
      הערה: הדגימות התקבלו מחולים שעברו כריתת קיבה, כריתת המעי הגס או כריתת הוושט ללא הטיה על בסיס גיל או מין. מי מלח הועברו למיכל ונשפכו לכל הבטן תוך דקה. זה מבוצע באופן שגרתי כמו שטיפת הצפק לאחר הניתוח ללא השפעות משמעותיות על החולים.
   2. יש לשטוף את חלל הבטן באופן נרחב למשך דקה < לפחות> הערה: מומלץ לערבב באיטיות את הנוזל המוחדר עם ידי המנתח כך שהדגימות יהיו אחידות.
   3. לשחזר 200 מ"ל של נוזל שטיפה עם ארבעה מזרקים 50 מ"ל.
      הערה: לפעמים, מחבר גומי משמש לקחת את הנוזלים.
2. בצע טיהור של LDN פריטוניאלי באמצעות mAb ספציפי גרנולוציטים, CD66b
   הערה: מכיוון ששכבת הביניים לאחר צנטריפוגת שיפוע צפיפות מכילה תאים חד-גרעיניים רבים, בוצעה סלקציה חיובית של נויטרופילים פולימורפים באמצעות CD66b mAb.
   1. מעבירים את נוזל שטיפת הצפק לצינור 50 מ"ל.
      הערה: בשלב זה, להעביר את הנוזלים דרך מסנן ניילון 100 מיקרומטר כדי להסיר זיהומים.
   2. צנטריפוגה את נוזל הצפק ב 270 x גרם במשך 7 דקות ב RT.
   3. להשעות מחדש את הכדורים ב 5 מ"ל של PBS עם 0.02% EDTA.
   4. שכב בזהירות את 5 מ"ל של תרחיף התא על תמיסת שיפוע צפיפות של 3 מ"ל.
   5. צנטריפוגה במהירות 1,700 x גרם למשך 15 דקות ב-RT ללא הפסקות.
   6. קצרו כ-2 עד 3 מ"ל של תמיסה שמכילה את שכבות הביניים (איור 1A) באמצעות פיפטה וערבבו אותה עם 10 מ"ל של PBS עם 0.02% EDTA.
   7. צנטריפוגה את נוזל הצפק ב 400 x גרם במשך 7 דקות ב RT ו להשליך את supernatant.
   8. הוסף עוד 10 מ"ל של PBS עם 0.02% EDTA וצנטריפוגה ב 270 x גרם למשך 7 דקות ב- RT. השליכו את הסופרנטנט.
   9. ממיסים את כדורית התא (1 x 10⁷) ב-60 מיקרוליטר של חיץ עבור ערכת הפרדת התאים המגנטית.
   10. הוסף 20 μL של בלוק Fc לכדוריות ודגור במשך 10 דקות ב 4 ° C.
   11. הוסף 20 μL של anti-CD66b מצומד עם microbeads ולדגור במשך 10 דקות נוספות ב 4 ° C.
   12. לשטוף ולהשעות מחדש את הכדורים ב 500 μL של מאגר MACS.
   13. החל את תרחיף התא על עמוד מגנטי בשדה המגנטי של מפריד מגנטי מתאים ואסוף את תאי הזרימה המכילים CD66b(-) על ידי שטיפת העמוד עם 15 מ"ל של חיץ.
   14. הסר את העמודה מהמפריד המגנטי ושטוף מיד את תאי CD66b(+) המסומנים מגנטית על ידי דחיפת הבוכנה בחוזקה לתוך העמודה.
       הערה: אוכלוסיית התאים CD66b(+) מורכבת בעיקר מנויטרופילים כפי שנקבע על ידי ניתוח FACS, המציין כי >95% מחלק CD66(+) חיוביים עבור CD11b, CD15 ו- CD16, אך שליליים עבור CD14.

תוצאות

איור 1: היווצרות נטו לאחר תרבית של LDN פריטוניאלי. (א)לאחר צנטריפוגת שיפוע צפיפות של נוזל שטיפה לאחר הניתוח, תאים התאוששו משכבת הביניים מוצגים. (B) לאחר מכן, CD66b(+) LDN הופרדו מתאי CD66b(-) חד-גרעיניים וגודלו בתרבית על לוחות 6 בארות מצופות פולי-L-ליזין, ולאחר מכן הוספת צבע צביעה גרעינית ותצפית מיידית במיקרוסקופ פלואורסצנטי. (C) אותו מספר של תאים חד-...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare, שבדיה	17-1440-02
ישרמדם™ שלם CD66B MicroBeads	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, גרמניה	130-104-913
בלוק FC	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, גרמניה	130-059-901
פתרון שטיפה MACS	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, גרמניה	130-091-222
תמיסת 0.5mol/l-EDTA (pH 8.0)	Nacalai tesque, יפן	06894-14
פתרון מניות MACS BSA	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, גרמניה	130-091-376
עמודות LS	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, גרמניה	130-041-306
מפריד מגנטי MACS	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, גרמניה	130-042-501