מיקרוסקופ פלואורסצנטי של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים או NETs: טכניקה לצפייה באינטראקציה דבקית בין תאים סרטניים לבין NETs

תקציר

מקור: Kanamaru, R. et al. מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים הנוצרות על ידי נויטרופילים בצפיפות נמוכה המתקבלים מנוזל שטיפת הצפק מתווכות צמיחה והתקשרות של תאי גידול. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את הצביעה הפלואורסצנטית של מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs), רכיבי הדנ"א החוץ-תאיים הנפלטים על ידי נויטרופילים. טכניקה זו מאפשרת הדמיה של אינטראקציה דבק בין תאים סרטניים ו- NETs.

פרוטוקול

1. צביעת תאי הגידול בצבע מקשר תאים פלואורסצנטי אדום

1. הכינו קווי תאים סרטניים אנושיים MKN45, NUGC ו-OCUM-1.
2. שטוף 1 x 10⁷ תאים עם PBS + 0.02% EDTA בצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 270 x גרם במשך 7 דקות ב RT.
3. מוסיפים 1 מ"ל תמיסה לצביעת צבע לכדוריות ולפיפטה בעדינות.
4. יש להמיס 4 μL של צבע פלואורסצנטי אדום ב-1 מ"ל תמיסה להכתמה ולערבב עם תרחיף התא משלב 1.2.
5. לדגור על הכדורים במשך 4 דקות ב- RT.
6. הוסף 4 מ"ל DMEM (10% FBS) כדי לעצור את תגובת הצביעה.
7. צנטריפוגה 270 x גרם במשך 7 דקות ולהשליך את supernatant.
8. חזור על שלבים 1.6 ו- 1.7 פעמיים.
9. בדוק במיקרוסקופ פלואורסצנטי (עירור = 551 ננומטר, פולט = 567 ננומטר) שתאי הגידול מוכתמים באדום.

2. ניתוח הידבקות תאי גידול ל- NETs

1. תרבית תאי נויטרופילים בצפיפות נמוכה בלוח מצופה פולי-L-ליזין בעל 6 בארות (קוטר 6 ס"מ) למשך שעתיים ב-37°C ב-5%_CO2, המאפשר ייצור מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות או NETs
2. להעביר את תאי הגידול המוכתמים פלואורסצנטי אדום (1 x 10⁶) ב 1 מ"ל של RPMI 1640 בתוספת 0.1% BSA.
3. הוסף את תאי הגידול לתרבית LDN שייצרה את ה- NETs.
4. יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37°C, המאפשרת לתאי הגידול ליצור קשר עם NETs.
   הערה: דגירה ארוכה גורמת להידבקות תאי הגידול ל-LDN או ללוחות.
5. הסר את המדיום ושטוף בעדינות את הבארות על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיה שחוממה מראש (0.1% BSA + RPMI 1640) וערבול המנה.
6. חזור על הליך הכביסה בשלב 2.5 פעמיים.
   הערה: מכיוון שרשתות נצמדות בצורה חלשה לצלחת, יש לבצע שטיפה עדינה ככל האפשר כדי למנוע הסרה של הרשתות עצמן.
7. הוסף צבע פלואורסצנטי ירוק לצביעת הגרעין והכרומוזומים בריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל להדמיית הרשת.
8. התבונן ב- NETs ובתאי הגידול המחוברים באמצעות המסננים המתאימים (ירוק, עירור = 504 ננומטר, פולט = 523 ננומטר; אדום, עירור = 551 ננומטר, פולט = 567 ננומטר).
9. מזג את הנתונים כדי להציג את תאי הגידול הלכודים על ידי NETs.
   הערה: בחלק מהניסויים, אנזים פירוק DNA נוסף לתרבית LDN (ריכוז סופי של 100 U/mL) 5 דקות לפני הדגירה המשותפת במשך 5 דקות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
SYTOX כתם חומצת גרעין ירוקה 5 mM תמיסה ב DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב (ארצות הברית)	S7020
ערכת קישור תאים פלואורסצנטיים אדומה PKH26 לתיוג כללי של קרום התא	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	עמ' 9691
RPMI1640 בינוני	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	₪220
אבקת אלבומין ליופילית בסרום בקר, ≥96% (אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז)	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	A2153
MICROPLATE מצופה פולי-L-ליזין 6Well	IWAKI, יפן	4810-040
סטריאומיקרוסקופ פלואורסצאין	BX8000, Keyence, אוסקה יפן	BZ-X710
MKN45 קו תאי סרטן קיבה אנושיים	Riken, Tukuba, יפן	לא ישים
NUGC-4 קו תאי סרטן קיבה אנושי	Riken, Tukuba, יפן	לא ישים
קו תאי סרטן קיבה אנושי OCUM-1	אוניברסיטת אוסקה סיטי, יפן	לא ישים	מתנת ד"ר מ. יאשירו
DNase I	Worthington , לייקווד ניו ג'רזי	LS002138
תמיסת 0.5mol/l-EDTA (pH 8.0)	Nacalai tesque, יפן	06894-14
עיט מעובד של Dulbecco גלוקוז בינוני-גבוה (DMEM)	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	D5796