מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים או NETs: טכניקה לניתוח אינטראקציה לאחר הידבקות בין תאים סרטניים ו- NETs

תקציר

מקור: Kanamaru, R. et al. מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים הנוצרות על ידי נויטרופילים בצפיפות נמוכה המתקבלות מנוזל שטיפת הצפק מתווכות צמיחה והתקשרות של תאי גידול. J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה, אנו מנתחים את ההתנהגות שלאחר ההדבקה של תאים סרטניים הכלואים במלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs) על ידי תרבית משותפת של נויטרופילים בצפיפות נמוכה ותאי סרטן קיבה. ניתוח הווידאו בהילוך מהיר מסייע לנטר אירועים תאיים שונים וללמוד את תפקידם של NETs בתנאים פתולוגיים.

פרוטוקול

1. ניתוח וידאו בהילוך מהיר של תאי הגידול הלכודים

1. תרבית את LDN הצפק בכלי עגול 35 מ"מ מצופה פולי-L-ליזין ולדגור במשך 2 שעות ב 37 ° C ב 5% CO₂.
2. הוסף את הצבע הירוק-פלואורסצנטי לצביעת הגרעין והכרומוזומים כדי להמחיש NETs בריכוז הסופי של 5 מיקרומטר.
3. לאחר דקה אחת של דגירה, להסיר את המדיה ולהוסיף 2 מ"ל של 0.1% BSA + RPMI 1640.
4. הסר את המדיה והוסף 1 x 10 לא מוכתמים⁶ תאי MKN45 מרחפים ב- 0.1% BSA + RPMI 1640. לדגור במשך 5 דקות ב RT.
5. הסר את כל תאי הגידול שאינם מחוברים על ידי שטיפה עדינה של הכלי על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיה שחוממה מראש (0.1% BSA + RPMI 1640) וערבול המנה.
6. חזור על הליך הכביסה לעיל פעמיים.
   הערה: מכיוון שרשתות נצמדות בצורה חלשה לצלחת, יש לבצע שטיפה עדינה ככל האפשר כדי למנוע הסרה של הרשתות עצמן.
7. הוסף DMEM עם 10% FCS בתוספת 100 u/mL פניצילין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין.
8. הרכיבו את צלחת התרבית במערכת תצפית תאים שלמה ובחרו את השדה המתאים שבו תאי הגידול לכודים על ידי הרשתות.
9. המשיכו בתרבית משותפת במשך יומיים נוספים וצלמו תמונות רציפות של השדה כל 6 דקות תחת אור ופלואורסצנטיות רגילים, המזהים תאי MKN45 ו-NET, בהתאמה.
10. הנח את התמונות בכל נקודת זמן ובנה סרטוני קיטועי זמן באמצעות תוכנת Image Viewer.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
SYTOX כתם חומצת גרעין ירוקה תמיסת 5mM ב- DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב (ארצות הברית)	S7020
RPMI1640 בינוני	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	₪220
עיט מעובד של Dulbecco גלוקוז בינוני-גבוה (DMEM)	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	D5796
חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS)	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	D8537
סרום בקר עוברי, אזורים מוסמכים, מאושרים על-ידי USDA	gibco by life technologies, מקסיקו	10437-028
אבקת אלבומין ליופילית בסרום בקר, ≥96% (אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז)	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	A2153
פניצילין סטרפטומיצין	לייף טכנולוגיות יפן	15140-122
פלסמוצין מניעתי	InvivoGen, סן דייגו, קליפורניה-ארה"ב (ארצות הברית)	אנט-MPP
סטריאומיקרוסקופ פלואורסצאין	BX8000, Keyence, אוסקה יפן	BZ-X710
מערכת תצפית תאי תצוגה שלמה	Nikon, Kanagawa, יפן	BioStudio (BS-M10)
MKN45 קו תאי סרטן קיבה אנושיים	Riken, Tukuba, יפן	לא ישים

מלח