הכנת בלוק אקסוזום: פרוטוקול לשימור אקסוזומים מתאי סרטן המעי הגס האנושיים בתרבית

תקציר

מקור: Jung, M. K. et al. הכנת דגימה והדמיה של אקסוזומים במיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מתאר את הטכניקה של הכנת בלוקים אקסוזומיים מתאי גידול במערכת העיכול בתרבית. גושי אקסוזום אלה יכולים גם להיות פרוסים, מוכתמים ומצולמים כדי לקבוע את המיקום של חלבונים ספציפיים בשלפוחית הדו-שכבתית השומנית.

פרוטוקול

1. לחסום הכנת אקסוזומים

1. פלטו את האקסוזומים מתרבית העל של תאי HCT116 על ידי צנטריפוגה ב 100,000 x גרם במשך 1.5 שעות. הסר את supernatant התרבית בזהירות לתקן את גלולת exosome מטוהר עם 1 מ"ל של 2.5% glutaraldehyde בתמיסת נתרן cacodylate 0.1 M (pH 7.0) במשך 1 שעה ב 4 ° C. עבור 0.1 M נתרן cacodylate, להמיס 4.28 גרם חומצה קקודילית ב 160 מ"ל של מים מזוקקים (DW). יש לכוונן את רמת החומציות ל-7.4 עם 0.1 M HCl, ולאחר מכן ליצור עד 200 מ"ל עם מים מזוקקים.
2. הסר את הקיבוע ושטוף את הכדוריות עם 1 מ"ל של 0.1 M נתרן cacodylate חיץ בטמפרטורת החדר. חזרו על הפעולה שלוש פעמים, כאשר כל החלפה נמשכת 10 דקות.
3. לאחר לתקן את הדגימה עם 1 מ"ל של 2% osmium tetroxide במשך 1 שעה ב 4 °C.
4. הסר את הקיבוע ושטוף שלוש פעמים עם חיץ נתרן קקודילט 0.1 M כל 10 דקות.
5. יש לדגור במשך 10 דקות עם סדרת אצטון מדורגת (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, בהתאמה) על השייקר.
6. מוציאים את האצטון ודגרים על תמיסה של 3:1 אצטון: תערובת הטבעה בצמיגות נמוכה למשך 30 דקות. הגלולה האקזוזום נמצאת בצינור.
7. מוציאים את המדיום ומוסיפים 1:1 אצטון: צמיגות נמוכה מטמיע תערובת בינונית, ולאחר מכן לדגור במשך 30 דקות.
8. מוציאים את המדיום ומוסיפים 1:3 אצטון: צמיגות נמוכה מטמיעה תערובת בינונית, ולאחר מכן לדגור במשך 30 דקות.
9. מוציאים את המדיום ומוסיפים תערובת הטבעה בצמיגות נמוכה 100% ודגרים לילה בטמפרטורת החדר.
10. הטמיעו את הדגימה בתערובת הטבעה טהורה בעלת צמיגות נמוכה באמצעות תבנית ההטבעה ואופים במשך 24 שעות ב-65°C.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
גלוטראלדהיד	EMS	16200
נתרן קקודילט	EMS	12300
אוסמיום טטרוקסיד 1 גר' גביש	EMS	19100	יש להשתמש רק במנדף
אצטון	ג'ונסיי	1B2031

אדים