חיתוך, צביעה והדמיית TEM של אקסוזומים משובצים: פרוטוקול להמחשת התכונות המבניות של אקסוזומים באמצעות TEM

Abstract

מקור: Jung, M. K. et al. הכנת דגימה והדמיה של אקסוזומים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון וידאו זה מתאר את הטכניקה להכנת קטע דק של אקסוזומים משובצים. ניתן גם לצבוע ולצלם חלקים אלה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, או TEM, כדי לחקור את התכונות המבניות של אקסוזומים.

Protocol

1. חתך האקסוזומים

1. הכינו בלוק אקסוזום על ידי הטמעת דגימת האקזוזום המטוהר (המתקבלת מתרבית העל של תאי HCT116) בתערובת הטבעה טהורה בצמיגות נמוכה.
2. חותכים את הבלוק האקזוזום בעובי 60 ננומטר דרך אולטרה-מיקרוטום.
3. כתם כפול עם 2% אורניל אצטט למשך 20 דקות ועופרת ציטראט למשך 10 דקות.
   עבור תמיסת העופרת של ריינולדס, יש להוסיף 1.33 גרם של חנקת עופרת ו-1.76 גרם נתרן ציטראט לסך של 50 מ"ל מים מזוקקים.
4. התבונן ברשת תחת מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ב 80 kV.
5. לחץ על "רכישה" ולאחר מכן לחץ על "קובץ" ו "שמירה בשם" במערכת מצלמות CCD תחת מיקרוסקופ אלקטרונים ב 80 kV. עקוב אחר הגדרות אוטומטיות עבור זמן החשיפה.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אולטרה-מיקרוטום	לייקה	UCT
אורניל אצטט	EMS	22400	כימיקלים מסוכנים
עופרת ציטראט	EMS	17900
מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת	היטאצ'י	H7600
רשת ניקל	EMS	G200-NI
רשת נחושת	EMS	G200-Cu
מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת	ג'אול	JEM2200FS