זהב immunostaining של חתכים אקסוזומליים: טכניקה כדי לדמיין סמנים אבחון לומן אקסוזומלי

תקציר

מקור: Jung, M. K., Mun, J. Y. הכנת דגימה והדמיה של אקסוזומים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה, אנו מדגימים צביעת זהב של סמנים ביולוגיים הממוקמים באזור לומן של חתכים אקסוזומליים דקים במיוחד. טכניקה זו מאפשרת אבחון מוקדם של מחלות על ידי הדמיה של מולקולות מטרה בתוך האקסוזומים המופרשים על ידי התאים החולים.

פרוטוקול

1. צביעה חיסונית של קטעי אקסוזום והדמיה

1. הכינו מקטעים דקים במיוחד של 60 ננומטר של בלוק אקסוזום באמצעות אולטרה-מיקרוטום ואספו אותם על רשת ניקל.
2. יש לדגור על הרשתות בטיפות של 50 מיקרוליטר של 0.02 מ' גליצין למשך 10 דקות כדי להרוות את קבוצות האלדהיד החופשיות.
3. יש לשטוף ב-100 מיקרוליטר של DW שלוש פעמים כל אחת למשך 10 דקות. לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת ב-PBS המכיל 1% BSA.
4. לדגור על הרשתות בטיפות של 50-100 μL של נוגדן נגד KRS (1:100 ב-PBS המכיל 0.1% BSA) למשך שעה אחת (במידת הצורך, שלב זה צריך להתבצע ב-4°C למשך הלילה).
5. שטפו את הרשתות בחמש טיפות נפרדות (50 מיקרוליטר) של PBS המכילות 0.1% BSA למשך 10 דקות כל אחת.
6. מעבירים את הרשתות לטיפות נוגדן משני למשך שעה אחת (IgG נגד ארנב מצומד לחלקיק זהב 10 ננומטר (1:100) ב-PBS המכיל 0.1% BSA).
7. שטפו את הרשתות בחמש טיפות נפרדות (50 מיקרוליטר) של PBS המכילות 0.1% BSA כל 10 דקות.
8. כתם כפול עם 2% אורניל אצטט למשך 20 דקות בתנאי חושך ועם ציטראט עופרת של ריינולד למשך 10 דקות, בהתאמה.
9. התבונן ברשתות תחת מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ב 80 kV.
10. לחץ על "רכישה" ולאחר מכן לחץ על "קובץ" ו "שמירה בשם" במערכת מצלמות CCD תחת TEM ב 80 kV. זמן החשיפה פעל לפי הגדרות אוטומטיות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אורניל אצטט	EMS	22400	כימיקלים מסוכנים
עופרת ציטראט	EMS	17900
מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת	היטאצ'י	H7600
רשת נחושת	EMS	G200-Cu
גליצין	סיגמא	022K5404
חיץ פוספט מלוחים	סיגמא	עמ' 4417
אלבומין בסרום בקר	אוריון	25557
נוגדן CD274 אנטי-אנושי מטוהר (B7-H1, PD-L1)	ביולג'נד	329710	הר שלם Immumogold
עכבר מטוהר IgG2b, κ איזוטיפ Ctrl	ביולג'נד	401202	הר שלם Immumogold (שליטה)
2nd Anti-עכבר IgG מצומד 9-11 ננומטר חלקיק זהב	סיגמא	G7652
פרפורמאלדהיד	EMS	19210