$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הקפאת שרירים והרכבה
- טבלו את החצי התחתון של פלסטיק קטנה (50 מ"ל) המכילה איזופנטאן בחנקן נוזלי. האיזופנטאן מוכן לשימוש כאשר הוא הופך צמיג מעט ויוצר למינציה לבנה מוצקה המצפה את החלק הפנימי של הכד (טמפרטורה: -160 °C).
הערה: השתמש תמיד בכלי ברונזה או אלומיניום ידניים שאינם נוצצים. יש להימנע מנשימת אדי המוצר. יש להשתמש עם אוורור הולם. אם התמודדות עם נזילה ואוורור אינה אפשרית או אינה מעשית, יש להצטייד במכונת הנשמה מתאימה.
- הקפיאו מעט מדיום הטבעה על צ'אק (פקק) על ידי טבילתו קצרה (10 שניות) באיזופנטאן.
- טפלו בשריר (למשל הטיביאליס או הגסטרוקנמיוס) על ידי החזקתו על ידי הגיד, אנכית ביחס לפקק, על מנת לשמור על כיוון הסיבים ולאפשר חתכי רוחב.
- מקמו בזהירות את החלק הסופי של השריר הטרי על גבי מדיום ההטבעה הקפוא.
הערה: השריר יידבק. חשוב לא להקיף לחלוטין את השריר במדיום הטבעה. חשוב גם לשמור על הכיוון האנכי לקביעה עוקבת של שטח החתך.
- טובלים את הצ'אק עם השריר המחובר לאמבט איזופנטאן (זמן ההקפאה הרגיל הוא 7-15 שניות, תלוי בגודל הדגימה ובהרכבה).
הערה: טבילה בתמיסת ההקפאה לא אמורה להימשך יותר ממה שנדרש כדי להקפיא לחלוטין את הדגימה. הקפאה ארוכה מדי תשבור את גוש הרקמה, בעוד שזמן קצר מדי יגרום להיווצרות גבישי קרח. דגימה קפואה היטב תהיה לבנה גירית.
- לאחר הקפאת הדגימה, הכניסו אותה לשקית ניילון קטנה או לצינור דגימה (50 מ"ל) ואחסנו אותה מיד במקפיא עמוק בטמפרטורה של -80°C או בחנקן נוזלי.
2. חתך שרירים
- הגדר את טמפרטורת העבודה של החדר הפנימי cryostat סביב -23 ° C.
- אפשר את הדגימה (מאוחסן בעבר ב -80 ° C) כדי להתאקלם בטמפרטורת העבודה (כמה שעות צריך להיות מספיק).
- חתכו חלקים מרובים בעובי 8 מיקרומטר של הדגימה (רצוי שרירי הטיביאליס הקדמיים או שרירי הגסטרוקנמיוס) ואספו אותם על מגלשות זכוכית.
הערה: חותכים את החלק באזור אמצע הבטן של השריר. כמו כן, למען הדיוק, לחתוך את החלקים בניצב לציר הרכבה.
- שמור את שקופיות הזכוכית בתוך תא ההקפאה. אל תתנו להם להפשיר אם המטרה היא לבצע מחקרי IF/IHC או צביעה אנזימטית.
- אחסן את השקופיות בטמפרטורה של -80°C לניתוחים נוספים.