Lamina Propria בידוד תאים חד-גרעיניים: טכניקת צנטריפוגה הדרגתית מבוססת סיליקה להשגת תאים חד-גרעיניים מהמעי הגס של מורין

תקציר

מקור: McManus, D. et al. בידוד תאים חד-גרעיניים lamina propria מהמעי הגס באמצעות collagenase E. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה, אנו מדגימים את הבידוד של תאים חד-גרעיניים lamina propria מרקמת המעי הגס על ידי עיכול אנזימטי באמצעות collagenase E והפרדת צפיפות מבוססת סיליקה הפרדת מדיה הדרגתית. התאים החד-גרעיניים המבודדים יכולים לשמש לניתוח במורד הזרם.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת פתרונות

1. כמתואר בטבלה 1, הכינו את מאגר המעי הגס, מדיית הפרדת צפיפות מבוססת סיליקה 100%, מדיית הפרדת צפיפות מבוססת סיליקה 66%, מדיית הפרדת צפיפות מבוססת סיליקה 44%, מאגר עיכול Collagenase E ומאגר FACS.
   1. הכינו את מאגר המעי הגס יום לפני ההליך ואחסנו למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
   2. הכינו אמצעי הפרדת צפיפות 100% על בסיס סיליקה יום לפני ההליך ואחסנו למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C, והניחו בטמפרטורת החדר בבוקר ההליך כדי להפשיר.
   3. הכינו חומרי הפרדה מבוססי סיליקה 66% ו-44% בבוקר הבידוד, באמצעות מדיית הפרדת צפיפות 100% מבוססת סיליקה בטמפרטורת החדר וחיץ המעי הגס.
   4. יש למדוד את הכמות המתאימה של Collagenase E המופק מ-Clostridium histolyticum ולאחסן בטמפרטורה של -20°C למשך הלילה שלפני ההליך. למחרת בבוקר, יש להמיס בנפח המתאים של מאגר המעי הגס כדי להפיק את מאגר העיכול של Collagenase. עבור כל הדגירות עם Collagenase Digestion Buffer ביום של ההליך, מראש לחמם את התמיסות ל 37 ° C.
2. עבור כל שלבי הפרוטוקול, שמור על צנטריפוגה אחת ב 20 ° C ומהירות סיבוב של 859 x g, עם בלמים מושבתים (0 האטה) עבור צנטריפוגה הדרגתית. הגדר עוד ל- 4 ° C ומהירות סיבוב של 859 x גרם, עם ההאטה הסטנדרטית, לשלבי שטיפה.

2. קצירת המעי הגס

1. הרדימו את העכבר באמצעות חנק CO₂ ולאחר מכן שיטת אישור שאושרה על ידי AALAC.
2. הניחו את העכבר במצב שכיבה ורססו את הפרווה באתנול 70%. באמצעות מספריים רקמה גדולה, לבצע חתך קו אמצע אנכי ולחשוף את הצפק שלם.
3. בעזרת מספריים לדיסקציה עדינה, לפתוח את הצפק. השתמש במלקחיים כדי להזיז את המעי הדק לצד אחד ולחשוף את המעי הגס היורד. משכו מעט כלפי מעלה על המעי הגס היורד כדי לחשוף באופן מקסימלי את החלק הרקטלי של המעי הגס. חותכים את פי הטבעת הדיסטלי עמוק באגן ומנתחים ומוציאים את כל המעי הגס כיחידה אחת, מפי הטבעת הדיסטלי ועד הכובע הצקלי.
4. מעבירים את המעי הגס במאגר מעי גס מקורר של 20 מ"ל בצינור פוליפרופילן של 50 מ"ל.

3. ניקוי המעי הגס

1. הניחו את המעי הגס על מגבת נייר לחה וחלצו את הצואה המוצקה על ידי הפעלת לחץ קל על דופן המעי עם הקצה הקהה של מספריים או מלקחיים.
2. הניחו את המעי הגס בצלוחית פטרי ושטפו את המעי ב-10 מ"ל של מאגר מעי גס צונן באמצעות מזרק 10 מ"ל עם מחט מילוי קהה 18G.
3. מעבירים את המעי הגס למגבת נייר לחה של מאגר המעי הגס ומסירים את המזנטריה והשומן בעזרת הקצה החד של המספריים.
4. הניחו את המעי הגס בצלחת פטרי מלאה ב-5-10 מ"ל חיץ מעי גס צונן המתסיס ידנית כדי לשטוף את שאר תכולת המעי הגס. חזרו על הפעולה 2-3 פעמים.
5. חתכו את המעי הגס לאורכו מהקצה הרקטלי השרירי יותר שלו ועד למעי הגס הפרוקסימלי (יצירת חתיכת מעי גס פתוחה מלבנית אחת) בצלחת פטרי מלאה במאגר מעי גס טרי וצונן. יש להשליך חומרי הדפסה קיימים ולמלא מחדש במאגר מעי גס נקי ומקורר.
6. שטפו את המעי 3 פעמים על ידי ערבול נמרץ בצלחת הפטרי והחלפת 5-10 מ"ל של חיץ המעי הגס המצונן לאחר כל שטיפה.
7. הניחו את רקמת המעי הגס המלבנית על מגבת נייר רטובה במאגר המעי הגס וחתכו אותה על ידי חיתוך אופקי ולאחר מכן לשברים קטנים (חתכים בגודל 3 מ"מ x 3 מ"מ).
8. אספו את שברי המעי הגס בזהירות באמצעות מלקחיים עדינים לתוך חיץ מעי גס צונן 20 מ"ל בצינור חרוטי פוליפרופילן 50 מ"ל.
9. שטפו את שברי המעי הגס שלוש פעמים, כל אחד שטף במאגר מעי גס של 20 מ"ל, על ידי ערבול נמרץ של הצינור במשך 30 שניות. בין כל תסיסה, אפשרו לשברי הרקמה לשקוע לתחתית הצינור. דקאנט או ואקום שואפים את הסופרנאטנט תוך מניעת אובדן שברי רקמה בתהליך השאיפה בין כל שטיפה.
   הערה: אין צורך להחליף את הצינור לאחר כל כביסה.

4. קולגןאז עיכול 1

1. הוסף 20 מ"ל של חיץ העיכול Collagenase לשברי המעי הגס שטופים בצינור חרוטי פוליפרופילן 50 מ"ל.
2. מניחים את הצינור הסגור 50 מ"ל ב 37 ° C ב שייקר מסלול מודגר עם קצב סיבוב מוגדר על 2 x גרם במשך 60 דקות. ודא שברי הרקמה נמצאים בתנועה מתמדת במהלך התסיסה; במידת הצורך, הגדל את קצב הסיבוב בהדרגה כדי להבטיח שאף שברי רקמה לא ישקעו לתחתית הצינור.

5. הכנת מעברי צבע של מדיית הפרדה על בסיס סיליקה

1. הכינו מדיית הפרדת צפיפות מבוססת סיליקה 66% ו-44%, תוך שימוש במדיית הפרדת צפיפות מבוססת סיליקה 100% בטמפרטורה של 20°C (טמפרטורת החדר) ובמאגר המעי הגס.
2. יש לשפוך 5 מ"ל של 66% מדיית הפרדת צפיפות מבוססת סיליקה לכל אחת משלוש שפופרות פוליפרופילן נפרדות בנפח 15 מ"ל. הכינו שלוש צינוריות לכל מעי גס. הדבר יוצר את בסיס הצפיפות הגבוהה יותר של הליך בידוד מעבר הצבע, שעליו יורכבו שכבות של אמצעי הפרדה בצפיפות נמוכה יותר כדי ליצור את מעבר הצבע של הפרדה.
3. יש לאחסן בטמפרטורה של 20°C עד לשימוש.

6. איסוף סופרנטנט מעיכול 1

1. אספו רק את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה סרולוגית של 25 מ"ל וסננו את הסופרנאטנט דרך מסננת תאי בד לסינון נקבוביות 40 מיקרומטר שהונחה בתוך צינור חרוטי פוליפרופילן נקי של 50 מ"ל, לאחר השלמת עיכול Collagenase 1. היזהר שלא לשאוף שברי רקמה קיימים.
   הערה: שמור את כל שברי הרקמה הגלויים שנותרו בצינור. אלה יעברו עיכול קולגנאז שני (שלב 8).

7. מרווה חיץ עיכול collagenase

1. מלא את צינור הפוליפרופילן 50 מ"ל לחלוטין במאגר המעי הגס הצונן.
   הערה: Collagenase פעיל ב 37 °C (77 °F); לכן חיץ מקורר משבית אנזים זה.
2. צנטריפוגה את הצינור ב 4 ° C ב 800 x גרם במשך 5 דקות.
   1. השליכו את הסופרנאטנט באמצעות שאיפת ואקום. יש לשטוף תאים עם 25 מ"ל של חיץ מעי גס טרי וצנטריפוגה במהירות של 800 x גרם למשך 5 דקות.
   2. יש להשהות מחדש את הגלולה בפחות מ-1 מ"ל של חוצץ מעי גס טרי וצונן.
   3. מניחים את צינור חרוט פוליפרופילן 50 מ"ל על קרח.

8. עיכול collagenase 2

1. חזור על שלב 4 (עיכול 1) כאשר שברי הרקמה הנותרים נשמרו משלב 6.1.

9. פירוק רקמות לאחר עיכול 2

1. שטפו את שברי הרקמה במרץ קדימה ואחורה בין הצינור למזרק 10 מ"ל דרך מחט קהה 18G.
2. חזור על שטיפה זו במשך 7-8 קטעים שלמים לפחות, והמשך עד שלא נראים שברי רקמה גסים או לכלוך.

10. סינון תאים

1. העבירו את מתלה פירוק הרקמה דרך מסננת תאי בד סינון לנקבוביות 40 מיקרומטר לתוך צינור פוליפרופילן נקי של 50 מ"ל.
2. שטפו את המסננת של תאי בד הסינון עם מאגר המעי הגס המצונן בנפח 10 מ"ל כדי לשחזר את כל התאים שנלכדו בפילטר.

11. מרווה עיכול collagenase

1. מלא את צינור חרוטי הפוליפרופילן 50 מ"ל לשפה עם חוצץ המעי הגס מקורר.
   הערה: הטמפרטורה של חיץ המעי הגס חיונית כדי להבטיח מרווה של פעילות collagenase.
2. Spin ב- 4°C וב- 800 x g למשך 5 דקות.
3. השליכו את הסופרנאטנט באמצעות שאיפת ואקום.
4. יש לשטוף על ידי השהיה מחדש ב-25 מ"ל של מאגר מעי גס טרי ומקורר, ולאחר מכן צנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C, 800 x גרם למשך 5 דקות.
5. השליכו את הסופרנאטנט באמצעות שאיפת ואקום.
6. אגרו את הגלולה המרחפת מ-Collagenase Digestion 1 (שלב 7) לצינור המתאים לה משלב 11.4.
7. חזור על שלב 11.4 (שטיפה וצנטריפוגה).

12. הפרדת צפיפות מבוססת סיליקה הפרדת מדפסים

הערה: בצע את שלבים 12-13 במהירות האפשרית כדי להבטיח מרווה מהירה של פעילות collagenase.

1. לאחר שלב 11.7, יש להשהות מחדש כל גלולה ב-24 מ"ל סה"כ של 44% מדיית הפרדת צפיפות מבוססת סיליקה לכל נקודתיים.
2. שכבה איטית של 8 מ"ל של המדיה משלב 12.1 על כל אחד משלושת הצינורות שהוכנו בשלב 5.2 (המכילים 66% מדיית הפרדת צפיפות מבוססת סיליקה), באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. שמור על זרימה יציבה ואיטית של מדיית ההפרדה בצפיפות של 44% תוך שכבות של מעבר הצבע כדי למנוע הפרעה לממשק.
3. אזנו בזהירות את כל הצינורות בתוך דליי הצנטריפוגות באמצעות סולם שקילה או איזון.
4. סובב את הצינורות 20 דקות ב 859 x גרם בצנטריפוגה ללא בלימה ב 20 ° C. אפשר לרוטורים להגיע למנוחה מוחלטת לפני הסרת הצינורות, תוך הקפדה לא להפריע לתאים בממשק השיפוע.

13. איסוף תאים חד-גרעיניים מממשק שיפוע

1. הצג באופן חזותי את ממשק מעבר הצבע (ליד סימן 5 מ"ל), שבו בדרך כלל קיים פס לבן בעובי 1-2 מ"מ (המכיל MNC).
   הערה: אפשר לראות או לא לראות פס לבן. עם זאת, MNC יהיה בממשק זה ואמור להעיב על בהירות ממשק השיפוע.
2. שאפו ואקום והשליכו את 7 מ"ל העליונים של השיפוע העליון כדי לאפשר גישה קלה יותר לפיפטה לממשק.
3. באמצעות יניקה ידנית רציפה ותנועה מסתובבת יציבה של שורש כף היד, אספו את שכבת הממשק של התאים לתוך צינור חרוטי פוליפרופילן נקי של 50 מ"ל. אסוף עד שהממשק בין שני מעברי הצבע יהיה ברור ומעשי (נקי מתאים ).
4. מלא את צינור האיסוף ב- 50 מ"ל של מאגר FACS מקורר. סחור ב-4°C, 800 x גרם במשך 5 דקות.
5. שאפו את הסופרנאטנט באמצעות שאיפת ואקום והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מאגר FACS.
6. ספרו את התאים על המוציטומטר בדילול של 1:2 תוך שימוש בשיטות מתאימות להרחקת תאים מתים.
7. המשך לצביעת FACS או בדיקות אחרות עם MNC מעי גס מבודד טרי.

טבלה 1: טבלת הכנת פתרונות

תמיסה	נוסחה
מאגר המעי הגס	500 מ"ל סל"ד + 10mM HEPES + 10% FBS (מנוטרל בחום ב 56oC למשך 60 דקות, pH מותאם ל 7.3)
צפיפות מבוססת סיליקה חומרי הדפסה הדרגתיים 100% (לכל נקודתיים)	22.5 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות מבוסס סיליקה + 2.5 מ"ל של 10x PBS.
צפיפות מבוססת סיליקה חומרי הדפסה הדרגתיים 66% (לכל נקודתיים)	10.72 מ"ל מדיום שיפוע צפיפות מבוסס סיליקה 100% + 5.28 מ"ל מאגר המעי הגס
צפיפות מבוססת סיליקה חומרי הדפסה הדרגתיים 44% (לכל נקודתיים)	11 מ"ל מדיום שיפוע צפיפות מבוסס סיליקה 100% + 14 מ"ל מאגר המעי הגס
Collagenase Digestion Buffer (לכל המעי הגס)	100 U/mL של Collagenase E מ Clostridium histolyticum, מומס ב 40 מ"ל מאגר המעי הגס
מאגר FACS	500 מ"ל 1x PBS + 5 גרם BSA + 1 מ"מ EDTA + 0.2 גרם נתרן אזיד

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת פטרי 60 מ"מ	תרמו סיינטיפיק	150288
1x PBS	קורנינג	21-040-CV
10x PBS	לונזה ביוויטאקר	BW17-517Q
10 מ"ל פיפטה סרולוגית חד פעמית	קורנינג	4100
מזרק 10 מ"ל	בקטון דיקינסון	302995
15 מ"ל צינורות חרוטי לא סטריליים	טרוליין	TR2002
18 גרם מחט קהה	בקטון דיקינסון	305180
25 מ"ל פיפטה סרולוגית חד פעמית	קורנינג	4250
גודל נקבוביות 40 מיקרומטר מסננת תאים	קורנינג	352340
50 מ"ל צינור בז	קורנינג	21008-951
אלבומין בסרום בקר (BSA)	סיגמא	A4503-1 ק"ג
מאגר קיבוע	ביואגדה	420801
E. coli Collagenase E מ Clostridium histolyticum	סיגמא	C2139
EDTA, 0.5 מטר תמיסה סטרילית	אמרסקו	E177-500ML
סרום בקר עוברי	תרמו/פישר סיינטיפיק -HyCLone	SV30014.03
HEPES	GE Healthcare-HyClone	SH30237.01
פרקול	GE שירותי בריאות-מדעי החיים	1708901
סל"ד בינוני	קורנינג	17-105-CV
נתרן אזיד	VWR מדעי החיים אמרסקו	97064-646
כחול טריפאן	לונזה ביוויטאקר	17-942E