כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. הקמת אורגנואידים פונדיים תלת-ממדיים שמקורם בבני אדם
NOTE: כדי למנוע זיהום, יש לבצע פרוטוקול בשלמותו בתוך תרבית רקמה סטרילית. רקמת קרן אנושית נאספה מחולים שעברו כריתת קיבה בשרוול.
- אספו את הרקמה ממטופלים שעברו כריתת קיבה בשרוול והניחו אותה במי מלח חוצצים (DPBS) קר כקרח Ca2+/Mg2+ נטול פוספט של Dulbecco במיכל פלסטיק גדול.
- בעזרת מלקחיים, שטפו את הרקמה במרץ בכד סטרילי המכיל DPBS ללא 100 מ"ל Ca2+/Mg2+. יש לשטוף במשך כ-30 שניות או עד להסרת הפסולת והדם. לאחר מכן, באמצעות גזה סטרילית, לנגב את השכבה הרירית מן האפיתל.
- בעזרת מלקחיים גדולים, אוחזים היטב בשכבת השריר של הרקמה, ובכוח, מגרדים את האפיתל באמצעות המלקחיים ההמוסטטיים הגדולים והמעוקלים. אספו את שברי האפיתל המשופשפים לצלחת פטרי סטרילית מפוליסטירן.
- טחנו את רקמת האפיתל לכ-2.0 x 2.0 מ"מ 2 מקטעים בגודל2 באמצעות סכיני גילוח כדי לייעל את עיכול הרקמות. שטפו את שברי הרקמה עם Ca2+/Mg2+ -free DBPS בתוספת אנטיביוטיקה (Ca2+/Mg2+ -free DPBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 0.25 מ"ג/מ"ל אמפוטריצין B /10 מ"ג/מ"ל גנטמיצין, 50 מ"ג/מ"ל קנמיצין), עד שהשטיפה נקייה מדם. בצעו שטיפות מרובות במידת הצורך. השליכו את הכביסה על ידי סינון זהיר של הכביסה דרך גזה סטרילית לתוך פסולת.
- יש לאסוף את השברים השטופים לתוך בקבוק תחתון עגול מזכוכית בנפח 125 מ"ל עם מוט ערבוב בקוטר 25 מ"מ ואמצעי דגירה שחוממו מראש (חומרי בסיס בתוספת 2 מ"מ L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 10 מ"מ חיץ HEPES, 1 מ"ג/מ"ל קולגנאז סוג 1, אלבומין בסרום בקר בתרבית תאים 2 מ"ג/מ"ל). אוטמים את הבקבוק התחתון העגול עם ספטה גומי.
- הכנס מחט עמוד שדרה 20G לתוך הספטה וחבר אותה למיכל חמצן עם צינור גומי. כדי לסנן מזהמים, הכנס נייר טישו לתוך הצינורית כדי ליצור מסנן. הפעל את זרימת החמצן על נמוכה. הכנס 10-15 מחטי זרימה לתוך הספטה כדי למנוע קרע של ספטה.
- הדקו את המערך למעמד טבעתי באמצעות מלחציים והניחו אותו באמבט מים מכויל ל-37°C עם צלחת ערבוב למשך 30-45 דקות. לאחר שהרקמה דגירה במשך 15 דקות, הסר 50 מיקרוליטר של מדיה הדגירה ובדוק חזותית בלוטות מנותקות. אם הבלוטות אינן צפופות או לא נפרדו מהרקמה, השאירו למשך 5-10 דקות נוספות.
- מיד לאחר הדגירה יש להוסיף 50 מ"ל DMEM/F-12 שחומם מראש לאמצעי הדגירה באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית או על ידי מזיגה ישירות לתערובת הדגירה.
- מסננים את תערובת הבלוטות דרך גזה סטרילית לארבעה צינורות חרוטיים של 50 מ"ל. שמור את התסנין על קרח במשך 15 דקות כדי לאפשר בלוטות שחולצו לשקוע לתחתית הצינור החרוט. היזהר לא להפריע בלוטות מיושבות; הסר והשלך את 40 מ"ל העליון של supernatant באמצעות פיפטה סרולוגית. להשעות מחדש את 10 מ"ל הנותרים ב 10 מ"ל של DPBS בתוספת אנטיביוטיקה.
- מפזרים את התערובת באופן שווה לתוך 5 מ"ל תרבית תאים מבחנות. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 65 x גרם ב 4 ° C ולהסיר את supernatant בזהירות באמצעות פיפטה.
הערה: חשוב לבצע שלב זה על הקרח ולהימנע מפילמור של מטריצת קרום המרתף בזמן הערבוב. בנוסף, חשוב לבדוק ויזואלית את צפיפות הבלוטה על ידי דגימה של 50 μL. הצפיפות האופטימלית היא ~ 70% מפגש.
- לאחר מכן, צלחת בלוטות ב 50 μL של מטריצת קרום המרתף באמצעות פיפטה רחבה. הימנעו מייצור בועות בזמן הציפוי.
- כדי לאפשר למטריצת קרום המרתף להתפלמר, יש לדגור במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורה של 37°C. אם מצפים בצלחת תרבית של 12 בארות, יש להוסיף 1 מ"ל של חומרי הדפסה hFGO (מדיום Eagle מדיום/F-12 בינוני של Advanced Dulbecco בתוספת 2mM L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 0.25 מ"ג/מ"ל Amphotericin B/10 מ"ג/מ"ל גנטמיצין, 50 מ"ג/מ"ל קנמיצין, 10 mM HEPES Buffer, 1 mM n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50% Wnt-conditioned medium, 20% R-spondin-conditioned medium בתוספת 100 ng/mL מעכב חלבון מורפוגנטי עצם, 1 nM gastrin, 50 ng/mL Epidermal Growth Factor, 200 ng/mL Fibroblast Growth Factor 10, 10 mM Nicotinamide, ו-10 μM Y-27632 ROCK inhibitor) לכל באר. אם אינכם משתמשים בצלחת תרבית בת 12 בארות, הוסיפו מספיק מדיה כדי לטבול את בועת מטריצת קרום המרתף.
- תרבית את התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור תרבית תאים לח 5% CO2. החליפו מדיה כל 4-5 ימים.
