$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת כלי נגינה, מדיה תרבותית ומנות
- Autoclave קבוצה אחת של מספריים מעיים, מספריים נורמליים, ומלקחיים במיכל סטרילי.
- מניחים צלחת 96 באר (תחתית שטוחה) באינקובטור ב 37 °C (77 °F).
- הכינו 10 מ"ל של מדיום תרבית שלם עם הריאגנטים המפורטים בטבלת החומרים.
- לדגור את המדיום המלא ב 37 ° C באמבט מים.
- הפשרה יצרה מחדש את קרום המרתף על ידי הצבתו בדלי קרח. קרום המרתף המשוחזר יהפוך לנוזלי ב -4 מעלות צלזיוס.
- מלאו ארבע צלחות פטרי במי מלח קרים חוצצים בפוספט או PBS (4°C).
2. בידוד של קריפטים במעי הדק
- הקרבה על ידי שאיפת CO2 עכבר Lgr5-eGFP-IRES-CreERt2 על רקע C57BL6/J. לנתח את הצפק לאורך עם זוג מספריים.
- החזיקו את הבטן עם המלקחיים וחתכו אותה לרוחב לשניים.
- בעזרת מספריים המעי מעתה והלאה, לשלוף את המעי ולהניח אותו בתוך צלחת פטרי המכילה PBS.
הערה: מספריים מעיים יש קצה חד ובוטה. הקצה הקהה של מספריים אלה נועד לא לפגוע בארכיטקטורה crypt-villus בעת פתיחת המעי.
- התחל על ידי הנחת קצה קהה לתוך הבטן בעדינות לדחוף אותו דרך פילורוס. המשך על ידי חיתוך עם המספריים ומשיכה עם המלקחיים.
- לאחר פתיחת המעי הדק כולו בצורה אורכית, שטפו אותו ב-PBS קר על ידי החזקתו במלקחיים ושטפו אותו בעדינות בתמיסת PBS בתנועות בצורת U.
- לאחר שכל שאריות הצואה פונו, המשיכו לשטח את המעי על קרש חיתוך, צד לומינלי כלפי מעלה. הצד המואר ניתן לזיהוי בקלות על ידי היעדר כלי דם ועל ידי המראה החיוור שלו בהשוואה לחלק החיצוני.
- בעזרת מגלשת זכוכית, הסירו בעדינות את הווילי על ידי גירוד המעי השטוח. בצע שלב זה פעמיים לכל אורך הרקמה.
- חותכים את המעי הדק עם להב כירורגי סטרילי לחתיכות 2-5 מ"מ.
- מניחים את שברי המעי הקטנים בצינור 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS קר כקרח.
- נקו את שברי הרקמות, הסירו את כל הלכלוך שנותר על ידי פיפטציה שלהם למעלה ולמטה ב- PBS. השליכו את הסופרנאטנט וחזרו על שלב זה עד שה-PBS יהיה ברור לחלוטין.
- הוסף PBS קר 15 מ"ל כדי להביא את הנפח הסופי הכולל של PBS ל 25 מ"ל. הוסף 2 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ודגור במשך 45 דקות על רולר ב 4 ° C.
- מחק את PBS/EDTA.
- הוסף 10 מ"ל של PBS ונתק את הקריפטות על ידי פיטום קשה של שברי הרקמה למעלה ולמטה (לפחות שלוש פעמים). לאסוף את supernatant.
- חזור על שלב 2.13 ארבע פעמים. הוסף מדיום תרבית כדי להגיע לנפח סופי של 50 מ"ל.
- גלול את התאים על ידי צנטריפוגה (300 x גרם במשך 5 דקות).
- להשהות את הגלולה ב 10 מ"ל של מדיום תרבית ו pellet את crypts על ידי צנטריפוגה (80 x גרם במשך 3 דקות).