בידוד מושבת תאים סרטניים גרורתית מתרנגולת CAM: הליך לבידוד תאים סרטניים מתרביות ביצים ללא קליפה

תקציר

מקור: Stoletov, K. et al. גילוי רגולטורים גרורתיים באמצעות מודל מהיר וכמותי של קרום צ'יק כוריואלנטואי. J. Vis. Exp. (2021)

בסרטון זה אנו מתארים את הבידוד של מושבות תאים סרטניים גרורתיים מממברנת כוריואלנטואית של תרנגולת (CAM) באמצעות תרבית ביצים ללא קליפה. שיטה זו מסייעת לסנן גורמים שעשויים להיות אחראים לגרורות סרטניות.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בידוד מושבות גרורתיות

1. ביום 5 לאחר ההזרקה, יש להוציא עוברים מהאינקובטור ולבדוק את העוברים CAMs לפיזור מושבה גרורתית. זהה את העוברים עם התפלגות מושבה אחידה שבה קיימות מושבות קומפקטיות (או פולשניות מדי.
   הערה: תהליך גידול עוברי תרנגולות אינו סטרילי, ולכן יש לבצע את כל שלבי הסינון בתנאים נקיים ביותר כדי למנוע זיהום עתידי בתרבית רקמות. זיהום הוא נדיר למדי וניתן להימנע ממנו בקלות על ידי לבישת כפפות ומסכה ושימוש בכלים סטריליים בלבד במהלך הזרקת תאים והליכי בידוד מושבה. מומלץ לבדוק עוברים בזה אחר זה כדי להקטין את חשיפתם לטמפרטורת המעבדה ולמנוע זיהום.
2. אתר את המושבה הגרורתית המעניינת. מושבה קומפקטית יכולה להיות מתוארת כמושבה שבה רוב התאים הסרטניים ממוקמים באזור מוגבל ברקמת CAM (תאים נראים "מגובשים יחד"). מושבה פולשנית יכולה להיות מתוארת כמושבה שבה תאים סרטניים "מתפזרים" ברקמת CAM (איור 1A, B).
   הערה: "קומפקטיות" של המושבה הגרורתית יכולה להיות מוסברת על ידי עיכוב של פלישת תאים סרטניים, עיכוב של התפשטות תאים סרטניים, או שניהם. יש לשים לב לכל התרחישים, ולבודד מושבות מגע (איור 1A, B). ניתן להשתמש בסטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי פשוט כדי להבחין בין פנוטיפים קומפקטיים ופולשניים של מושבות גרורתיות.
3. מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה, משכו בעדינות את רקמת ה-CAM שמכילה את המושבה הגרורתית כלפי מעלה באמצעות מלקחיים עדינים (איור 1C).
4. חותכים את רקמת ה-CAM המכילה את המושבה הגרורתית באמצעות מספריים כירורגיים.
5. מעבירים את רקמת ה-CAM המכילה את המושבה הגרורתית לתוך צינור ריק וסטרילי של 1.5 מ"ל (על קרח) וסוגרים את מכסה הצינור.
   הערה: מושבות מבודדות יכולות להישמר על קרח עד 3 שעות ללא אובדן כדאיות.
6. חזור על הליך הכריתה עד שכל המושבות המעניינות נאספות לצינורות נפרדים. כדי למנוע סבל של בעלי חיים, אין להוציא יותר מ 2-3 מושבות מעובר אחד. יש להרדים עוברים על ידי הקפאה בטמפרטורה של -20°C (או שיטה מאושרת אחרת) מיד לאחר כריתת המושבה.
7. טחנו בעדינות את רקמת ה-CAM בצינור מיקרוצנטריפוגה באמצעות מחט סטרילית של 18G. השתמש במחט נפרדת לכל מושבה.
8. הוסף 100 μL של תמיסת collagenase 1x ודגור במשך 30 דקות ב 37 ° C.
9. סובב את התאים ואת רקמת ה- CAM במהירות של 300 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת הסביבה.
10. שאפו את תמיסת הקולגנאז והשהו מחדש תאים במדיה מלאה המשמשת לקו התאים המעניין.
    הערה: בדרך כלל, רקמת CAM אינה מנותקת לחלוטין לאחר טיפול בקולגנאז, ותאים סרטניים יתרבו תחילה בתוך חתיכות רקמת CAM ורק לאחר מכן ינדדו לצלחת תרבית הרקמה.
11. סובבו שוב את התאים ואת רקמת ה-CAM במהירות של 300 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת הסביבה.
12. השהה מחדש תאים וחתיכות רקמת CAM ב 1 מ"ל של מדיה מלאה בתוספת גורם בחירה (אם בכלל), ולאחר מכן להעביר לתוך צלחת אחת 12 באר תרבית רקמה היטב.
    הערה: פיברובלסטים מסוג CAM עוף עשויים להתמיד בתרבית רקמה במשך מעברים מרובים המעכבים את התפשטות השבט. היכולת להרחיב את המושבות הגרורתיות בנוכחות גורם ברירה (כלומר, אם וקטור ששימש לעיבוד תאים סרטניים פלואורסצנטיים מקודד גם גן עמידות לאנטיביוטיקה של יונקים) עשויה להאיץ מאוד את התפשטות השבטים. יש לבצע ניסוי עקומת הרג לפני ההקרנה כדי להבטיח שימוש בריכוז הנכון של אנטיביוטיקה.
13. במשך 1-3 השבועות הבאים, עקוב אחר תאים סרטניים מדי יום לצמיחה וזיהום.
14. כאשר התאים מגיעים ל-70-80% מהמפגש, מעבירים את התאים לצלחת תרבית בנפח גדול יותר.
    הערה: מומלץ להרחיב תאים עד שניתן יהיה להקפיא לפחות שני בקבוקונים קריוגניים מכל שיבוט. שמירה על כמויות גדולות של תרבית רקמה יכולה להיות מייגעת ומיותרת.
15. המשך לריצוף או לסבב הבחירה הבא ברגע שמגיעים למספיק מספרי תאים סרטניים. באופן כללי, 1 x 10⁶ של תאים סרטניים מספיקים עבור טכניקות מודרניות ריצוף תפוקה גבוהה.
16. המשיכו להזרקה מחדש של שיבוט והדמיה וכימות של קומפקטיות מושבה או מגע בין תאים סרטניים לכלי דם (איור 2A). לחלופין, המשך לרצף בתפוקה גבוהה או חזור על בחירת המושבה.
    הערה: כדי להקטין את מספר התוצאות החיוביות השגויות, מומלץ לבצע לפחות שני סבבי בחירה. שתי גישות יושמו בהצלחה. 1) להרחיב כל שיבוט ולהזריק מחדש בנפרד כדי לאשר את פנוטיפ המושבה. 2) מערבבים את כל השיבוטים המורחבים ביחס של 1:1 כל אחד, מזריקים מחדש כתערובת, וחוזרים על מחזור הבחירה.

תוצאות

איור 1. תוצאות מייצגות עבור שלבים שונים של פרוטוקול המיון.(A) מושבות גרורתיות שנוצרו על ידי תאי HEp3 הטרוגניים (תאי קו תאי סרטן מותמרים בספרייה), 5 ימים לאחר ההזרקה. חץ אדום מראה מושבה קומפקטית (פגיעה חיובית פוטנציאלית) שיש לכרות. (B) מושבות גרורתיות הנוצרות על ידי אחת מפגיעות המסך המבודדות (KIF3B) לאחר הזרקה חוזרת, 5 ימים לאחר ההזרקה. כניסות מצי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
15 מ"ל צינורות צנטריפוגות חרוטיות.	קורנינג	CLS430791-500EA
18 מד x 1 1/2 BD דיוק מחט	ב.ד.	BD305196	אנו משתמשים 1.2 מ"מ x 40 מ"מ, זה אפשרי לשימוש במחטים קצרות יותר במידת הצורך
צנטריפוגת ספסל.	מקורות רבים זמינים		כל צנטריפוגה תואמת TC אשר ניתן להשתמש כדי לסובב את התאים הוא מתאים
קולגנאז	סיגמא	C0130-100MG
צמר גפן	מקורות רבים זמינים		יש לעקר לפני השימוש
מדיה תרבותית המתאימה לתא קווים בשימוש	מקורות רבים זמינים		אנו מגדלים HT1080, HEp3 ו- b16 cell קווים ב- DMEM, 10% מדיה FBS
אינקובטור ביצים	מקורות רבים זמינים		מודל מדויק שהכרחי תלוי בקנה המידה של המסך. המקורות הזמינים הם MGF Company Inc., סוואנה, ג'ורג'יה או Lyon Electric Company Inc. , צ'ולה ויסטה, קליפורניה
צינורות אפנדור , 1.5 מ"ל	סיגמא	T4816-250EA
ביצי לגהורן לבנות מופרות	כל ספק מקומי
מלקחיים עדינים	מקורות רבים זמינים		חייב להיות מעוקר לשימוש מראש
תוכנה לניתוח תמונות			אנו משתמשים ב-Nikon Elements
PBS (1x)	מקורות רבים זמינים
כלי שקילת פלסטיק	סימפורט	CA11006-614	המידות הן 78x78x25mm; many מקורות אחרים זמינים
מספריים כירורגיים קטנים	מקורות רבים זמינים		יש לעקר לפני השימוש
מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאופוני			אנו משתמשים Zeiss Lumar v12