בידוד ותרבית תאי אפיתל לשון מורין: הליך לבידוד ותרבית תאי אפיתל לשון ממודל עכבר

תקציר

מקור: Prasad, M. et al. במבחנה הקמת קו תאי סרטן ראש וצוואר מהונדס גנטית באמצעות מערכת וירוס Cas9 הקשורה באדנו. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה אנו מתארים את הבידוד של תאי אפיתל מלשון מורין. תאים אלה יכולים להיות תרבית נוספת כדי ליצור מושבות תאים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בידוד ותרבית של תאים ראשוניים

1. להרדים B6 זכר או נקבה בני 6 שבועות; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J על ידי חנק CO₂ או כל פרוטוקול אחר שאושר על ידי IACUC.
   הערה: לעכברי CRISPR/Cas9 knockin אלה יש ביטוי תלוי Cre recombinase של cas9 endonuclease ו- EGFP המכוון על ידי מקדם CAG. רצף Lox-Stop-Lox (LSL) הקיים בגנום של עכברים אלה מונע ביטוי של Cas9 ו-EGFP בהיעדר Cre recombinase. כאשר משתמשים בהם בשילוב עם רנ"א מנחה יחיד (sgRNAs) ומקור Cre, הם מאפשרים עריכה של גנים של עכבר יחיד או מספר גנים in vivo או ex vivo.
2. נתחו את הלשון מהעכברים שעברו המתת חסד באמצעות מספריים כירורגיים.
3. נתק ידנית את הרקמה על ידי טחינת רקמת הלשון לשברים קטנים מאוד באמצעות אזמל. לאסוף את שברי הרקמה בצינור 15 מ"ל המכיל 4.5 מ"ל של RPMI רגיל בינוני (ללא סרום).
4. הוסיפו את תערובת האנזימים המשולשת (200 μL) (ראו טבלה 1 למתכון) לשברי הרקמות.
5. יש לדגור על תערובת רקמות-אנזימים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות ולהקיש על הצינור כל 10 דקות כדי לשפר את הדיסוציאציה האנזימטית של הרקמה.
6. הוסף סרום בקר עוברי 5% (FBS) המכיל HBSS/PBS לתערובת רקמות-אנזימים כדי לעצור את פעולת האנזים.
7. סנן את תרחיף התאים לעיל דרך רשת ניילון סטרילית של 70 מיקרומטר כדי להפריד בין התאים המפוזרים לבין חלקי רקמה גדולים יותר.
8. שטפו את מתלה התא המסונן בצנטריפוגה למשך 300 x גרם למשך 5 דקות ב-HBSS/PBS ב-RT.
9. משעים מחדש את הגלולה בתווך תרבית (10% FBS בסל"ד/DMEM) וגדלים בצלחות תרבית בקוטר 60 מ"מ עד להיווצרות מושבות תאים נפרדות.
   1. אגרגטים של תאי תרבית נשמרים על גבי המסנן בצלחת תרבית בקוטר 60 מ"מ המכילה 3 מ"ל מדיה שלמה (10% FBS בסל"ד/DMEM) עד להיווצרות מושבות תאים.
10. לבחון מיקרוסקופית את התאים הראשוניים עבור נוכחות של זיהום פיברובלסט לאחר שבוע של תרבית. טפל בתאים הראשוניים שפותחו מאגרגטים ומתרחיפים של תאים עם תמיסת 0.25 טריפסין 0.02% EDTA ב-37°C למשך דקה אחת כדי להסיר פיברובלסטים.
    הערה: בדרך כלל התרבית הראשונית מצברי תאים מייצרת יותר מושבות בהשוואה לתרחיפים חד-תאיים. התאים ממושבות אלה מספקים יעילות התמרה טובה יותר עם התמרה AAV.

10X Triple Enzyme Stock פתרון:
קולגנאז	1 גרם קונק סופי. [10 מ"ג/מ"ל]
היאלורונידאז	100 מ"ג [1 מ"ג/מ"ל]
דנאז	20,000 יחידות קונק סופי [200 מ"ג/מ"ל]
PBS 1X	לעשות עד 100 מ"ל

טבלה 1: מתכון החיץ ששימש במחקר זה

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
זני עכברים
C57BL/6	אנוויגו
ב6; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAGcas9*,-EGFP)Fezh/J	מעבדות ג'קסון	24857
הנהון. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)	אנוויגו
אנזימים
בנזונאז	סיגמא	E1014
קולגנאז IV	תרמו פישר סיינטיפיק	17104019
DNAse	תרמו פישר סיינטיפיק	18047019
היאלורונידאז	MilliporeSigma	H3506
טריפסין	תעשיות ביולוגיות ישראל בית העמק בע"מ	03-050-1B
תרבות, מדיה, כימיקלים וריאגנטים
BSA	אמרסקו	0332-TAM-50G
DMEM	תעשיות ביולוגיות ישראל בית העמק בע"מ	01-055-1א
פ.ב.ס.	תעשיות ביולוגיות ישראל בית העמק בע"מ	04-127-1א
HBSS	סיגמא	H6648
PBS	תעשיות ביולוגיות ישראל בית העמק בע"מ	02-023-1א
מאגר Tris	מרק מיליפור	648311-1 ק"ג
כלי פלסטיק
מסנן Amicon-ULTRA 100 KDa	מיליפור	UFC910024
0.22 מיקרומטר מסננים סטריליים, 4 מ"מ	מילקס	SLGV004SL
0.45 מיקרומטר מסננים סטריליים, 13 מ"מ	מילקס	SLHV013SL
צלחות תרבות	גריינר ביו-וואן
צינורות בז	גריינר ביו-וואן