טיפול מקדים ברקמת FFPE עבור RNA CISH: הליך לעיבוד קטעי רקמה משובצים פרפין קבועים פורמלין עבור RNA כרומוגני באתרו הכלאה

תקציר

מקור: Outh-Gauer, S. et al. הכלאה כרומוגנית באתרו ככלי לאבחון סרטן ראש וצוואר הקשור ל- HPV. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את השלבים הכרוכים בטיפול מקדים בדגימות רקמת FFPE עבור הכלאה כרומוגנית של RNA באתרו. תהליך הטיפול המקדים מסייע בשמירה על שלמות חומצות הגרעין בתוך התאים ועל המורפולוגיה הכוללת של הרקמה.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. הכנת החומרים

1. הכנת מגיב אחזור מטרה 1x
   1. בכד גדול, הוסף 70 מ"ל של מגיב אחזור מטרה פי 10 (ראה טבלת חומרים) ל- 630 מ"ל מים מזוקקים.
   2. מניחים את הכד על צלחת חימום עם מערבל מגנטי. מכסים אותו ברדיד אלומיניום.
   3. מרתיחים את תכולתו ב 100 ° C במשך 10-15 דקות.
      הערה: אין לתת לו להרתיח במשך יותר מ-30 דקות.

2. טיפול מקדים לרקמות

הערה: שלבים אלה עוקבים אחר ההמלצה "הסטנדרטית" לטיפול מקדים בהתאם להוראות היצרן לדגימות ראש וצוואר. ייתכן שיהיה צורך להתאים את העיתוי של סעיפים 2.1 ו- 2.2 בהתאם לרקמה שעברה מניפולציה.

1. מצור על פעילות פרוקסידז
   1. הוסיפו 4-6 טיפות של מי חמצן (ראו טבלת חומרים) לכל שקופית ודגרו עליהן במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. שטפו את המגלשות פעמיים במשך 2 דקות במים מזוקקים בטמפרטורת החדר.
2. שבירה של גבולות RNA/רקמות
   1. בעזרת טופר, הסירו את רדיד האלומיניום מגיב שליפת המטרה הרותח 1x (TTR1x) שהונח על צלחת חימום והפסיקו לערבב. טבלו את מדף השקופיות לאט ובזהירות רבה למשך 15 דקות. כסו שוב את הכד ברדיד אלומיניום.
      הערה: הבעבוע חייב להימשך במהלך שלב זה.
      זהירות: השתמש בטופר כדי לתפעל את רדיד האלומיניום ואת מתלה השקופיות כדי למנוע פציעות כוויות. הקפידו ללבוש ציוד מגן אישי מתאים, כגון כפפות ומעיל מעבדה.
   2. בעזרת הטופר, העבירו מיד את מתלה המגלשה החמה לאמבט מים מזוקקים ושטפו אותו למשך 2 דקות.
      הערה: ודא שהדגימות אינן מתקררות ב- TTR1x.
   3. שטפו את המגלשות באתנול 100% טרי למשך 2 דקות.
   4. הניחו למגלשות להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
3. יצירת מחסום
   1. בעזרת עט מחסום הידרופובי (ראו טבלת חומרים), ציירו מחסום מסביב לדגימה. תן לו להתייבש לפחות 5 דקות.
      הערה: תנו למחסום להתייבש באמת. אם הוא נשחק במהלך ההליך, אל תהססו לצייר אותו שוב. הימנע מלגעת ברקמה עם העט. ניתן להשהות את הפרוטוקול למשך הלילה כאן.
4. עיכול פרוטאז
   1. הניחו את השקופיות על מדף השקופיות והוסיפו ~4 טיפות של פרוטאז פלוס לכל דגימה (ראו את טבלת החומרים).
   2. מכסים את מגש בקרת הלחות במכסה ומכניסים אותו לתנור ההכלאה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 40°C.
      הערה: כדי למנוע אידוי, ודא שידית הסיבוב מסובבת לחלוטין למצב הנעילה.
   3. הוציאו את המגש מהתנור והוציאו את מתלה המגלשה.
   4. מגלשה אחת בכל פעם, הסירו במהירות את עודפי הנוזלים והניחו את המגלשה במדף שקופיות שקוע בכלי מכתים מלא במים מזוקקים.
   5. שטפו את המגלשות פעמיים במשך 2 דקות במים מזוקקים בטמפרטורת החדר. להתסיס כל הזמן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תנור HybEZ (110v)	Advanced Cell Diagnostics Inc.	321710
מתלה שקופיות HybEZ	Advanced Cell Diagnostics Inc.	300104
עט מחסום הידרופובי ImmEdge	Advanced Cell Diagnostics Inc.	310018
RNAscope H202 ופרוטאז פלוס מגיב	Advanced Cell Diagnostics Inc.	322330	מימן פרוקסיד x2 ופרוטאז פלוס x 1
ריאגנטים לאחזור מטרות RNAscope	Advanced Cell Diagnostics Inc.	322000