הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכלאת בדיקה והגברת אותות בהכלאה של RNA באתרו: טכניקה לאיתור רצפי RNA ספציפיים במקטעי רקמות

3.2K צפיות

30 באפריל 2023

במאמר זה

תקציר

מקור: Outh-Gauer, S. et al. הכלאה כרומוגנית באתרו ככלי לאבחון סרטן ראש וצוואר הקשור ל- HPV. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מתאר אסטרטגיית הכלאה רציפה הכוללת הכלאה של גשושיות mRNA ל-mRNA מטרה ספציפי. לאחר הכלאת הגשושיות, הגברת האות מבוצעת כדי לשפר את הרזולוציה באמצעות הפחתת יחס אות לרעש במהלך RNA-CISH של דגימות היסטולוגיות.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. הפעלת הבדיקה

NOTE: אין לתת למקטעים להתייבש בין שלבי הדגירה.

  1. הכלאה של בדיקת HPV
    הערה: ודא שהגשושיות מחוממות מראש כדי להמיס משקעים לפני השימוש. בשלב זה, במקום בדיקת HPV, ניתן להשתמש גם בפפטידיל-פרוליל איזומראז B (PPIB) לבקרה חיובית או בדיהידרודיפיקולין רדוקטאז (DAPB) לבקרה שלילית (ראה טבלת חומרים).
    1. הקש ו/או החלק את השקופיות כדי להסיר נוזלים עודפים ולמקם אותם במדף השקופיות. הוסף ~ 4 טיפות של בדיקת HPV כדי לכסות לחלוטין כל קטע.
    2. מכסים את המגש במכסה ומכניסים לתנור למשך שעתיים ב-40°C.
      הערה: כדי למנוע אידוי, ודא שידית הסיבוב מסובבת לחלוטין למצב הנעילה.
    3. הוציאו את המגש מהתנור והוציאו את מתלה המגלשה.
    4. שקופית אחת בכל פעם, הסר במהירות את עודפי הנוזלים והנח את המגלשה במדף שקופיות שקוע בכלי מכתים מלא במאגר כביסה אחד.
    5. שטפו את המגלשות במאגר כביסה אחד למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה מתמדת. חזור על פעולה זו עם חיץ כביסה טרי 1x.
  2. הכלאה של AMP1, AMP2, AMP3 ו-AMP4
    הערה: שלבים אלה כוללים הכלאה בתנור ההכלאה ו-AMP1–AMP4 מהערכה שנרכשה (ראו טבלת חומרים).
    1. הקש ו/או החלק כדי להסיר נוזלים עודפים מהשקופיות ולמקם אותם במדף השקופיות. הוסף ~ 4 טיפות AMP1 כדי לכסות לחלוטין כל קטע.
    2. מכסים את המגש במכסה ומכניסים לתנור למשך 30 דקות בחום של 40°C.
    3. הוציאו את המגש מהתנור והוציאו את מתלה המגלשה.
    4. שקופית אחת בכל פעם, הסר במהירות את עודפי הנוזלים והנח את המגלשה במדף שקופיות שקוע בכלי מכתים מלא במאגר כביסה אחד.
    5. שטפו את המגלשות במאגר כביסה אחד למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה מתמדת. חזור על פעולה זו עם חיץ כביסה טרי 1x.
    6. חזור על שלבים 1.2.1-1.2.5, אך השתמש ב~4 טיפות AMP2 במקום AMP1 ודגר במשך 15 דקות ב-40°C. שטפו את המגלשות פעמיים במשך 2 דקות, בשתי הפעמים במאגר כביסה טרי.
    7. חזור על שלבים 1.2.1-1.2.5, אך השתמש ב~4 טיפות AMP3 במקום AMP1 ודגור במשך 30 דקות ב-40°C. שטפו את המגלשות 2x במשך 2 דקות, בשתי הפעמים במאגר כביסה טרי.
    8. חזור על שלבים 1.2.1-1.2.5, אך השתמש ב~4 טיפות AMP4 במקום AMP1 ודגור במשך 15 דקות ב-40°C. שטפו את המגלשות פעמיים במשך 2 דקות, בשתי הפעמים במאגר כביסה טרי.
  3. הכלאה של AMP5 ו- AMP6
    הערה: שלבים אלה אינם כוללים הכלאה בתנור אלא הכלאה בטמפרטורת החדר. AMP5 ו-AMP6 מגיעים מהערכה שנרכשה (ראו טבלת חומרים).
    1. הקש ו/או החלק את השקופיות כדי להסיר נוזלים עודפים ולמקם אותם במדף השקופיות. הוסף ~ 4 טיפות AMP5 כדי לכסות לחלוטין כל קטע.
    2. מכסים את המגש במכסה ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. שקופית אחת בכל פעם, הסירו במהירות את עודפי הנוזלים והניחו אותם במדף שקופיות שקוע בכלי מכתים מלא במאגר כביסה אחד.
    4. שטפו את המגלשות במאגר כביסה אחד למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה מתמדת. חזור על פעולה זו עם חיץ כביסה טרי 1x.
    5. חזור על שלבים 1.3.1-1.3.4, אך השתמש ב~4 טיפות AMP6 במקום AMP5 ודגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את המגלשות פעמיים במשך 2 דקות, בשתי הפעמים במאגר כביסה טרי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תנור HybEZ (110v) Advanced Cell Diagnostics Inc. 321710
מתלה שקופיות HybEZ Advanced Cell Diagnostics Inc. 300104
RNAscope 2.5 HD ריאגנטים לזיהוי-BROWNAdvanced Cell Diagnostics Inc.322310ערכה זו כוללת ריאגנטים להגברה AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 ו-AMP6, וריאגנטים לגילוי DAB-A ו-DAB-B
בדיקת בקרה שלילית RNAscope 3-Plex Advanced Cell Diagnostics Inc.320871DAPB
בדיקת בקרה חיובית RNAscope 3-Plex Advanced Cell Diagnostics Inc.320861פי"ב
בדיקת RNAscope- HPV16/18 Advanced Cell Diagnostics Inc.311121
ריאגנטים של מאגר שטיפה RNAscopeAdvanced Cell Diagnostics Inc.310091חיץ כביסה 50X x4

תגיות

RNA ZHPV