RNA CISH Signal Detection: טכניקה לזיהוי אותות כרומוגניים במהלך הכלאה של RNA באתרו בדגימות רקמות שלמות

תקציר

מקור: Outh-Gauer, S. et al. הכלאה כרומוגנית באתרו ככלי לאבחון סרטן ראש וצוואר הקשור ל- HPV. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מציג את פרוטוקול זיהוי האותות במהלך הכלאה כרומוגנית של RNA באתרו. טכניקה זו יכולה לשמש לאבחון זיהום אונקוגן פעיל חזותית בדגימת רקמה שלמה.

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים נגד צביעה

1. הכינו 50% המטוקסילין.
   1. במנדף מוסיפים 100 מ"ל של המטוקסילין I של גיל (ראו טבלת חומרים) ל-100 מ"ל מים מזוקקים בצלחת מכתים.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בתמיסת צביעת המטוקסילין 50% למשך עד שבוע.
2. הכינו 0.02% (עם v) מי אמוניה (מגיב הדבקה).
3. במכסה האדים, להוסיף 1.43 מ"ל של 1 N אמוניום הידרוקסיד ל 250 מ"ל של מים מזוקקים בגליל מדורג או במיכל אחר. אוטמים את הגליל בסרט פרפין. מערבבים היטב את תכולתו עבור 3x–5x.
   הערה: עבור כימות הבדיקה, זה קריטי להשתמש אמוניום הידרוקסיד. ניתן להכין את הריאגנטים מראש. ודא שכל המכולות נשארות מכוסות.

2. זיהוי אותות עם 3,3'-diaminobenzidine

זהירות: Diaminobenzidine (DAB) הוא רעיל. פעל בהתאם לאמצעי זהירות מתאימים ולהנחיות בטיחות בעת השלכת כימיקל זה והטיפול בו.

1. ערבבו נפחים שווים של DAB-A ו-DAB-B (ראו טבלת חומרים) בצינור בגודל מתאים על ידי חלוקת אותו מספר טיפות של כל תמיסה. הפוך ~ 120 μL של מצע DAB לכל קטע (~ 2 טיפות של כל מגיב / סה"כ 4). מערבבים היטב עבור 3x-5x.
2. קח כל שקופית, אחת בכל פעם, ממדף השקופיות והקש ו/או החלק כדי להסיר את עודפי הנוזלים לפני שתניח אותה במדף השקופיות.
3. פיפטה ~ 120 μL של DAB על כל קטע רקמה. יש לוודא שהחלקים מכוסים ולדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
4. השליכו את ה-DAB הנותר בהתאם לרגולציה המקומית והכניסו את המגלשה למדף שקופיות שקוע בכלי מכתים מלא במי ברז.

3. צביעת נגד

1. העבירו את מדף השקופיות לצלחת צביעה המכילה תמיסת צביעה של 50% המטוקסילין, הניחו אותה למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. שימו לב שהשקופיות יהפכו לסגולות.
2. העבירו מיד את מתלה המגלשות בחזרה לצלחת מכתימה המכילה מי ברז ושטפו את המגלשות פי 3-5 על ידי הזזת המתלה למעלה ולמטה.
3. המשיכו לחזור על שלב הכביסה עם מי ברז טריים עד שהמגלשות נקיות בעוד המקטעים נשארים סגולים.
4. החליפו את מי הברז בכלי הצביעה במי אמוניה 0.02%. הזז את ארון התקשורת למעלה ולמטה פי 2x–3x. שים לב שמקטע הרקמה צריך להפוך לכחול.
5. החליפו את מי האמוניה במי ברז. שטפו את המגלשות 3x–5x.

4. התייבשות

1. העבירו את מדף המגלשה לצלחת מכתימה המכילה 70% אתנול במכסה האדים ותנו לו לנוח במשך 2 דקות עם תסיסה מדי פעם.
2. העבר את מדף המגלשה לצלחת צביעה ראשונה המכילה 100% אתנול ותן לו לנוח במשך 2 דקות עם תסיסה מדי פעם.
3. העבר את מדף המגלשה לצלחת צביעה שנייה המכילה 100% אתנול ותן לו לנוח במשך 2 דקות עם תסיסה מדי פעם.
4. העבירו את מדף המגלשה לצלחת מכתימה המכילה קסילן והניחו לו לנוח במשך 5 דקות עם תסיסה מדי פעם.

5. הרכבה על שקופיות

1. הסר את המגלשות ממדף המגלשות והנח אותן שטוחות, כאשר המקטעים פונים כלפי מעלה במכסה האדים.
2. הרכבה של שקופית אחת בכל פעם על-ידי הוספת טיפה אחת של אמצעי הרכבה מבוסס קסילן לכל שקופית והנחת כיסוי של 24 מ"מ x 50 מ"מ בזהירות מעל המקטע. הימנעו מלכידת בועות אוויר.
3. יבשו את המגלשות באוויר למשך ≥5 דקות.

6. הערכה מדגמית

1. בחן את חלקי הרקמה תחת מיקרוסקופ שדה בהיר סטנדרטי בהגדלה של 20x-40x.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיסת המטוקסילין, גיל מספר 1	מרק	GHS132
RNAscope 2.5 HD ריאגנטים לזיהוי-BROWN	Advanced Cell Diagnostics Inc.	322310	ערכה זו כוללת ריאגנטים להגברה AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 ו-AMP6, וריאגנטים לגילוי DAB-A ו-DAB-B
בדיקת RNAscope- HPV16/18	Advanced Cell Diagnostics Inc.	311121
מתלה שקופיות HybEZ	Advanced Cell Diagnostics Inc.	300104
עט מחסום הידרופובי ImmEdge	Advanced Cell Diagnostics Inc.	310018