קצירת DRG מעמוד השדרה של חולדה: הליך לחילוץ גנגליון שורש גבי מעמוד השדרה של מודל חולדה

תקציר

מקור: Schmidt, L. B. et al. The chick chorioallantoic membrane in vivo model to assessment perineural invasion in head and neck cancer. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה אנו מדגימים מיצוי גנגליון שורש גבי או DRG מעמוד שדרה של חולדה שנקטפה עבור יישומים במורד הזרם.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. קציר והכנה של DRGs (תזמון משוער: 2 שעות, יום 8)

הערה: ניסויים בעכברים ובחולדות דורשים אישור מה-IACUC. במדינות מסוימות, גם השימוש בביצי תרנגולת דורש אישור.

1. קבל שש עד שבע חולדות Sprague Dawley בנות שבוע (~ 200 גרם במשקל) כדי לחלץ DRGs.
   הערה: חולדה אחת צריכה להניב ~ 40 DRG צוואר הרחם ובית החזה. עכבר DRG משתלב גם ב- CAM; עם זאת, התנאים עבור מין זה צריכים להיות אופטימליים באופן עצמאי.
2. בארון זרימה למינרי, קצרו DRG מאזורי צוואר הרחם ובית החזה בהתאם לפרוטוקול למיצוי DRG עכבר שפורסם במקום אחר. עקבו אחר איור 1 לקבלת התמצאות כיצד לקצור DRGs.
   1. הרדימו את החולדה על ידי ניקוב לב לאחר מתן קטמין/קסילזין בהזרקה תוך צפקית. נקו את עור החולדה באתנול 70% והוציאו את עמוד השדרה של החולדה בעזרת מספריים. אין לבצע פריקת צוואר הרחם מכיוון שהדבר יפגע ב- DRG צוואר הרחם.
   2. הפרידו את אזורי צוואר הרחם, בית החזה והמותניים בעזרת אותו מספריים, בהתאם לייצוג האנטומי הסכמטי ולתמונות הגסות המוצגות באיור 1A-D. הניחו את חלקי עמוד השדרה בכלי תרבית בקוטר 10 ס"מ עם 1X PBS כדי לשמור על רקמות רטובות.
   3. בעזרת מספריים עדינים לעצמות, פתחו את עצמות החוליות בהיבט הגבי והגחוני, והפרידו את עמוד השדרה בשני חצאים רוחביים (איור 1E-F). הניחו את חלקי הרקמה בכלי נקי בקוטר 10 ס"מ עם PBS 1X טרי.
   4. באמצעות מלקחיים, נתקו בעדינות את חוט השדרה מעצמות החוליות כדי להמחיש את ה-DRG (איור 1G).
   5. בעזרת מלקחיים עדינים המוחזקים מתחת לכל DRG, אחזו בו ומשכו אותו החוצה מחלל העצם שבו הוא תקוע. אין להחזיק את DRG ישירות מכיוון שהדבר יגרום נזק לרקמות. אל תחתוך את חבילות האקסון מה-DRG (איור 1H).
      הערה: הימנע משימוש ב- DRG מותני מכיוון שאלו הפחיתו את האינטגרציה ב- CAM. עבור מיקום אזור DRG, עקבו אחר האיור הסכמטי והתמונות האנטומיות הגסות באיור 1A-D.
3. מיד לאחר הקציר, הכניסו כל DRG למדיום תרבית DMEM בתוספת 2% פניצילין/סטרפטומיצין (Pen/Strep) ו-10% סרום בקר עוברי (FBS) מומת חום כדי לסייע במניעת זיהום חיידקי של DRGs. קבצו את כל ה-DRGs באותה צלחת תרבית בקוטר 6 ס"מ עם 4 מ"ל מדיום תרבית.
4. לאחר קצירת כל ה-DRGs, העבירו אותם לצלחת תרבית חדשה עם מדיום תרבית DMEM בתוספת 2% Pen/Strep בתוספת 10% FBS ומכיל 1.25 מיקרוגרם/מ"ל צבע פלואורסצנטי אדום. לדגור במשך שעה אחת באינקובטור תרבית התא.

תוצאות

איור 1: מיצוי DRG ביום 8. A. סכמת חולדה הממחישה את המיקום האנטומי של עמוד השדרה. B. תרשים של תצורת חוליות החולדה המציג אזורי גוף שונים; ירוק לצוואר הרחם, כחול כהה לבית החזה, כתום למותני ותכלת לחוליות העצה. ג-ד. אספקט גחוני של עמוד השדרה של החולדה לאחר כריתה כירורגית; הפרדת האזורים כפי שמודגם ב-ב'. ה. דיסק...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
PBS (1x) pH 7.4	גיבקו	# 10010-023	פוספט חוצץ מלוחים
חולדות Sprague Dawley (נקבות)	מעבדות נהר צ'ארלס	קוד זן: 001	בן 6-7 שבועות (משקל 190-210 גרם)
Dumont # 5 מלקחיים עדינים	כלים מדעיים יפים (FST)	# 11254-20	משמש לקציר DRG
מלקחיים Graefe עדינים במיוחד, מעוקלים	כלים מדעיים יפים (FST)	# 11151-10	משמש להשתלת DRG על CAM ביום 8 ולקצירת רקמת CAM ביום 17
מלקחיים Graefe דק במיוחד, ישר	כלים מדעיים יפים (FST)	# 11150-10	משמש להשתלת DRG על CAM ביום 8 ולקצירת רקמת CAM ביום 17
DMEM (1x)	גיבקו	# 11965-092	מדיום הנשר המעובד של Dulbeecco
CellTracker צבע פלואורסצנטי אדום CMTPX	לייף טכנולוגיות	# C34552	צור מחדש 50μg ב- 40μL של DMSO ומלאי ב- -20oC. השתמש 1μL של פתרון מלאי / מ"ל של מדיום תרבות
עט/סטרפ	גיבקו	# 15140-122	10,000 יחידות/מ"ל פניצילין, 10,000 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין
היי FBS	גיבקו	# 10082-147	סרום בקר עוברי מומת בחום
DMSO	פישר ביוריאגנטים	# BP231-100	דימתיל סולפוקסיד