Chick Chorioallantoic Membrane או CAM Tumor Model: שיטת In Ovo להדמיית פלישה פריעצבית של תאי גידול

תקציר

מקור: Schmidt, L. B. et al. The chick chorioallantoic membrane in vivo model to assessment perineural invasion in head and neck cancer. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה, אנו מתארים את השיטה לתרבית משותפת של גרעיני שורש גביים ותאים סרטניים על קרום כוריאואלנטואי אפרוח או CAM כדי לחקור פלישה פריעצבית.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. השתלת DRG ב-CAM (תזמון משוער: 40 דקות, יום 8)

1. הכינו תבנית תרבית בקוטר 6 ס"מ עם מדיום HBSS לשטיפת ה-DRG לפני ההשתלה. הביאו את הביצים המוכנות לארון הזרימה הלמינרית של תרבית התא. הסירו את קרום הפרפין מהביצה (איור 1A).
2. בעזרת מלקחיים סטריליים עדינים, אחזו בעדינות ב-DRG אחד מתוך מדיום התרבית. טבלו אותו בתווך HBSS כדי להסיר את התווך העודף המכיל את הצבע הפלואורסצנטי. החזק את DRG בעדינות רבה; אחרת, הוא יידבק למלקחיים.
3. הניחו את ה-DRG על ה-CAM, תוך זהירות שלא לנקב את הממברנה (איור 1B-C). במידת הצורך, השתמש בזוג מלקחיים נוסף כדי לעזור לנתק את DRG מקצה המלקחיים בעת הנחתו על CAM.
   הערה: שמירה על DRG רטוב עם מדיום HBSS תקל גם על ניתוק מהמלקחיים.
4. מכסים את הביצה ברוטב סרט סטרילי שקוף. כסו את כל החלונות והנקבים המיוצרים בקליפת הביצה כדי למנוע זיהום חיידקי (איור 1D).
5. לאחר השתלת DRGs בכל הביצים, לדגור על הביצים באינקובטור לחות ב 38 ° C ו 54% לחות במשך 2 ימים, ללא סיבוב.

2. השתלת תאי גידול ב-CAM (תזמון משוער: שעה ו-30 דקות, יום 10)

1. ב 48 שעות לפני השתלת התאים, צלחת את התאים הדרושים צלחות תרבית. חשב 0.5 עד 1 x 10⁶ תאים לביצית עבור תאי UM-SCC-1 על מנת ליצור גידולים תלת מימדיים ב- CAM. שים לב שמספר התא עשוי להשתנות בהתאם לקו התא.
2. שאפו מדיום והוסיפו מדיום תרבית DMEM בתוספת 1% Pen/Strep בתוספת 10% FBS ו-2.5 מיקרוגרם/מ"ל צבע פלואורסצנטי ירוק. דגירה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית התא. לאחר מכן, בדקו את עוצמת הפלואורסצנטיות במיקרוסקופ, שאפו מדיום, שטפו פעם אחת עם 1X PBS והוסיפו 0.25% טריפסין למשך עד 10 דקות. נטרול טריפסין עם תוספת DMEM בינונית.
3. צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 4 דקות כדי ליצור גלולה התא. יש לשאוף מדיום DMEM ולהשהות מחדש ב-HBSS כדי לשטוף את עודפי הצבע הפלואורסצנטי. ספירת תאים באמצעות המוציטומטר.
4. הביאו את הביצים לארון הזרימה הלמינרית של תרבית התא. בעזרת מספריים ומלקחיים, פתחו את הלבישה השקופה שמכסה את הביצה (איור 1E-F).
5. צנטריפוגו שוב את מספר התאים המחושב, שאפו את תווך HBSS והשהו מחדש בריכוז סופי של 0.5 עד 1 x 10⁶ תאים לכל 5 מיקרוליטר של אותו תווך (איור 1G). הכינו את הכמות הדרושה למספר הכולל של ביצים (5 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל ביצה).
6. הניחו 5 מיקרוליטר של תמיסת תאים על גבי ה-CAM, במרחק של כ-2 מ"מ מה-DRG (איור 1H). שמור על מרחקים אחידים בין DRG לבין תאים. היזהר מאוד לא להפריע לביצית כדי למזער את התפשטות התאים.
   הערה: כדי להתחיל בהשתלת תאים, בחר ביצים שבהן משטח ה- CAM יבש חזותית. אם פני השטח רטובים מדי, תאים יכולים להתפשט ולא ליצור גידולים רגילים.
7. מכסים את הביצה ברוטב סרט חדש כמו בשלב 1.4. להשתיל את התאים בכל הביציות. דוגרים על הביצים באינקובטור לחות בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס ולחות של 54% במשך 7 ימים, ללא סיבוב.

תוצאות

איור 1: השתלת DRG, תאים וקצירת CAM: ביום 8: A. CAM נצפה בקלות לאחר הסרת קרום שעוות פרפין. ב-ג. בעזרת מלקחיים עדינים, DRG מונח על ה-CAM. D. הביצה מכוסה בהלבשת סרט ומכניסים לאינקובטור; החצים מצביעים על הפתחים המכוסים. ביום 10: E-F. הלבשת הסרט מוסרת ו- DRG ממוקם (ראש חץ על F). ג-ה. 5 μL של תמיסת התא יורד על...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אינקובטור ביצים	GQF Digital Sportsman	#1502	אינקובטור ביצים מצויד בתרמוסטט דיגיטלי מסובב אוטומטי, בקרות טמפרטורה ולחות
חותך חריטה	דרמל	#108	משמש לקידוח קליפת הביצה
מלקחיים Graefe עדינים במיוחד, מעוקלים	כלים מדעיים יפים (FST)	#11151-10	משמש להשתלת DRG על CAM ביום 8 ולקצירת רקמת CAMtissue ביום 17
מלקחיים Graefe דק במיוחד, ישר	כלים מדעיים יפים (FST)	#11150-10	משמש להשתלת DRG על CAM ביום 8 ולקצירת רקמת CAM ביום 17
ביצים מופרות של לוהמן לבן לגהורן			ביציות מופרות בימי הפריה מוקדמים, רצוי ביום הראשון שלאחר ההפריה. ביצים המשמשות בפרוטוקול זה הן מחוות העופות של אוניברסיטת מישיגן.
מסנן מלקחיים	EMD Millipore	#XX6200006P	מלקחיים קהים המשמשים להסרת קליפת הביצה
HBSS (1x)	גיבקו	#14025-092	תמיסת המלח המאוזנת של האנק
קרום שעוות פרפין	סרט מעבדה Parafilm	#PM-996	משמש לכיסוי זמני של פתחי הביציות עד להשתלת DRG ביום8
PBS (1x) pH 7.4	גיבקו	#10010-023	פוספט חוצץ מלוחים
Tegaderm הלבשת סרט שקוף	3 דקות	#9505W	סטרילי, 6x7 ס"מ המשמש לכיסוי פתחי הביצים במהלך הדגירה

;