מידול טיפול תוך גידולי עם מעכבי miRNA: שיטה לניתוח ההשפעה של מעכבי miRNA על צמיחת הגידול במודל Murine

תקציר

מקור: Ramirez-Moya, J. et al. In vivo עיכוב של מיקרו-רנ"א כדי להקטין את צמיחת הגידול בעכברים. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את העברת in vivo של מעכבי miRNA כסוכנים טיפוליים נגד צמיחת הגידול במודלים אורתוטופיים של עכברים. מתן תוך-גידולי של מעכבי miRNA סינתטיים או אנטגומירים מאפשר להם לקשור ולעכב miRNA אנדוגניים, ובכך לגרום להגברת הרגולציה של mRNA ולדיכוי צמיחת הגידול.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. חיסון איגוף של תאים וטיפול אנטגומי תוך גידולי

1. הכנת תאים
   1. מהנדס קו תאי סרטן בלוטת התריס האנושי Cal62 (מוטציות KRASG12R ו-p53A161D) כדי לבטא יתר על המידה מבנה מהונדס המבטא באופן מכונן GFP ולוציפראז (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). בחר את התאים הטרנסגניים על ידי עמידות לאנטיביוטיקה או על ידי מיון התאים החיוביים GFP עם ציטומטריית זרימה.
   2. לגדל את התאים בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת פניצילין, סטרפטומיצין וסרום בקר עוברי 10% (FBS) ב 37 ° C ו 5% CO₂.
   3. להשהות 1 x 10⁶ תאים ב 50 μL של מלוחים חוצצים פוספט (PBS) ב 4 ° C.
2. חיסון תאים לצדי עכברים
   1. מערבבים את התאים עם אותה כמות של מטריצת קרום מרתף. לדוגמה, הוסף 1 x 10⁶ תאים ב- 50 μL של PBS ל- 50 μL של מטריצת קרום מרתף (ראה טבלת חומרים) וערבב בעדינות.
   2. יש להזריק 100 μL של הדגימה (תאים במטריצת PBS + קרום מרתף) באופן תת-עורי לאגף השמאלי של עכברי BALB/c nu/nu בני 6 שבועות בעלי כשל חיסוני בן 6 שבועות באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל עם מחט 27G 1/2 אינץ' (0.4x13 מ"מ).
3. טיפול אנטגומי תוך גידולי
   1. להשהות את antagomiR (ראה טבלה של חומרים) או את הבקרה השלילית ב 500 μL של מים מזוקקים ללא RNase.
   2. לפני ההזרקה, הכינו 2 ננומול של האנטגומיר או את הבקרה יחד עם מגיב מסירה in vivo (ראו טבלת חומרים) לכל הזרקה.
      1. ראשית, ערבבו את תמיסת האנטגומיר (ראו טבלת חומרים) ואת מאגר המורכבות (ראו טבלת חומרים) ביחס של 1:1. לדוגמה, הוסף 80 μL של תמיסת מעכבי miRNA (16 nmol) ל- 80 μL של חיץ מורכבות (כלול בערכת מגיב משלוח in vivo, ראה טבלת חומרים).
      2. הביאו את מגיב המשלוח in vivo לטמפרטורת החדר. הוסף 160 μL לצינור 1.5 מ"ל ומיד הוסף 160 μL של תמיסת antagomiR מדוללת. החזר את המגיב הנותר ל -20 °C. במידת הצורך, אחסנו את המגיב בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע לאחר ההפשרה.
      3. מערבולת מיד (10 שניות) כדי להבטיח מורכבות של מגיב משלוח in vivo - אנטגומיר.
      4. לדגור על תערובת מגיב-אנטגומיר משלוח in vivo במשך 30 דקות ב 50 ° C. צנטריפוגה את הצינור לזמן קצר כדי לשחזר את הדגימה.
      5. לדלל את הקומפלקס פי 6 על ידי הוספת 1360 μL של PBS pH 7.4 ולערבב היטב.
      6. המשך עם משלוח in vivo של קומפלקס מגיב-אנטגומיר (8 עכברים / מצב) או לאחסן את המתחם ב 4 ° C עד שבוע לפני ההזרקה. להזריק 200 μL תוך גידולי לתוך כל גידול (2 nmol של antagomiR).
         הערה: הנפח והכמות של האנטגומיר אינם תלויים בנפח הגידול.
   3. בצע את הטיפול 3 פעמים בשבוע (שני, רביעי ושישי) במשך שבועיים.
4. ניתוח צמיחת הגידול
   1. יש להזריק 50 μL של תמיסה 40 מ"ג/מ"ל של מצע D-luciferin (ראה טבלת חומרים) תת עורית בכל נקודת זמן עם מזרק 1 מ"ל עם מחט 27G 1/2" (0.4 מ"מ x 13 מ"מ).
      1. 8 דקות לאחר ההזרקה, מרדימים את העכברים באמצעות 3% isoflurane מעורבב עם חמצן. להעריך את רמת ההרדמה על ידי רפלקס הדוושה (צביטת בוהן מוצקה) ולהתאים את מתן ההרדמה לפי הצורך כדי לשמור על מישור הניתוח.
      2. החל משחה אופתלמית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות.
5. צלם את האות הביו-לומינסנטי באמצעות תוכנת הדמיה in vivo (ראה טבלת חומרים).
   הערה: ניתן להשתמש בקליפרים גם כדי למדוד את נפח הגידול ואת צמיחת הגידול.
6. לאחר קבלת אותות הביולומינסנציה, נתח את הגידול הגידול בהשוואה בין שני הטיפולים וקבע את המשמעות באמצעות מבחן t. כדי לנתח את השונות בתוך הקבוצה, השתמש ב- SEM.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מטריצת קרום מרתף: מטריצת קרום מרתף מטריגל ריכוז גבוה	קורנינג	#354248
AntagomiR: מעכב miRNA mirVana	תרמו פישר	4464088	מוכן ל-In vivo
מגיב משלוח in vivo: מגיב Invivofectamine 3.0	תרמו פישר	הפריה חוץ גופית 3005
שליטה שלילית: מעכב mirVana miRNA, שליטה שלילית #1	תרמו פישר	4464077	מוכן ל-In vivo
XenoLight D-Luciferin - K+ מצע ביולומינסנט מלח	פרקיןאלמר	122799	מדולל ב-PBS
תוכנת הדמיה In vivo: IVISLumina II מערכת הדמיה	קליפר מדעי החיים