הטמעת ספרואידים תלת ממדיים בטיפות ג'ל אגרוז: טכניקה לשימור ספרואידים לניתוח במורד הזרם

במאמר זה

תקציר

מקור: Rolver, M. G. et al. הערכת כדאיות תאים ומוות בתרביות כדוריות תלת-ממדיות של תאים סרטניים. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מתאר את הטכניקה להטמעת ספרואידים תלת-ממדיים בטיפות ג'ל אגרוז לשימור. ניתן להשתמש בספרואידים התלת-ממדיים המשובצים לניתוח במורד הזרם.

פרוטוקול

1. הטבעה של ספרואידים תלת ממדיים

הכינו את ג'ל האגרוז לתוכו מוטמעים הספרואידים (יש צורך רק בפעם הראשונה בביצוע הפרוטוקול)
1. מערבבים 1 גרם של bacto-agar ב 50 מ"ל של ddH₂O.
2. מחממים לאט בתנור המיקרוגל עד שהבקטו-אגר מתמוסס ונוצר ג'ל הומוגני. אין לאפשר לג'ל לרתיחה.
3. שמור את bacto-agar חם באמבט מים ב 60 ° C.
4. יש לשמור על טמפרטורה של 4°C בין ניסוי לניסוי.
הטבעה של ספרואידים
1. ביום הראשון, עבור כל מצב, אגרו לפחות 12 ספרואידים בצינור של 1.5 מ"ל.
2. יש לשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל של 1X PBS קר כקרח.
3. כדי לתקן את הספרואידים, להוסיף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde.
  הערה: הטיפול בפרפורמלדהיד צריך להתבצע במכסה אדים.
4. תן להם לדגור במשך 24 שעות ב RT.
5. ביום השני, חממו בזהירות את ג'ל האגרוז על ידי הכנסתו לכוס מלאה במים במיקרוגל. ודא כי הג'ל אינו רותח. יש לחמם על פלטת חימום בטמפרטורה של 60°C עד לשימוש.
6. יש לשטוף ספרואידים פעמיים עם 1 מ"ל של 1X PBS קר כקרח.
7. שאפו את רוב ה-1X PBS (השארת כ-100 מיקרוליטר בשלב זה היא מעשית לטיפול בכדורים).
8. הכינו פיפטה של 20 מיקרוליטר על-ידי חיתוך קצה הפיפטה בשיפוע כדי לקבל קצה מחודד יותר עם חור גדול יותר (איור 1).
  הערה: החלק הבא צריך להיעשות במהירות כדי להבטיח העברת ספרואידים אופטימלית וכדי למנוע התמצקות של טיפת ג'ל. אם אין בלוק חימום זמין, מומלץ לתפוס תחילה את הספרואידים ולאחר מכן לגרום לאגרוז לרדת (כלומר, להחליף את סדר הנקודות 1.2.9 ו- 1.2.10).
9. הפוך טיפת ג'ל אגרוז על מגלשת מיקרוסקופ. הניחו את המגלשה על בלוק חימום חם כדי למנוע מהאגרוז להתמצק.
10. באמצעות קצה פיפטה שונה (שלב 1.2.8), לתפוס כמה שיותר spheroids בנפח של 15-20 μL.
11. יש להזריק בזהירות את 1X PBS 15-20 μL המכיל ספרואיד למרכז טיפת הג'ל אגרוז מבלי לגעת בשקופית המיקרוסקופ.
  הערה: זו נקודה קצת קשה. הספרואידים יאבדו אם קצה הפיפטה ייגע במגלשת המיקרוסקופ בעת הזרקת הספרואידים לטיפת הג'ל. מומלץ לתרגל את כל התהליך של הכנת טיפת האגרוז והזרקת הספרואידים על ידי הזרקת נוזל צבעוני לתוך הטיפה. זה יאפשר הדמיה של חדירה פוטנציאלית דרך הטיפה, כמו הנוזל הצבעוני יהיה לדלוף החוצה על המגלשה.
12. תן לג'ל האגרוז לרדת להתקשות על ידי דגירה במשך 5-10 דקות ב RT או ב 4 ° C. לאחר טיפת הג'ל התמצקה מעט (אך עדיין רכה למדי), דחפו בזהירות את טיפת הג'ל משקופית המיקרוסקופ לתוך קלטת רקמה מפלסטיק עם אזמל.
13. מכסים את קלטות רקמת הפלסטיק באתנול 70%.
  הערה: בשלב זה, ניתן להשתמש בכדורידים ישירות או לאחסן אותם במשך חודשים.
14. הטמיעו את הספרואיד המשובץ באגרוז בפרפין, חתכו לשקופיות שכבה בעובי 2–3 מיקרומטר, והכתימו בהמטוקסילין ואאוזין או בכפוף לצביעה אימונו-היסטולוגית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

figure-results-1
איור 1: קיבוע, הטבעה וניתוח אימונוהיסטוכימי של ספרואידים. (A) ייצוג סכמטי של פרוטוקול ההטבעה של ספרואידים. שלבים בודדים מסומנים כ- (i-vii). (B) תמונה של ספרואיד MDA-MB-231 משובץ. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. (C) תמונה מייצגת של ספרואיד MDA-MB-231 שעבר טיפול כימותרפי שעבר ניתוח IHC עם נוגדנים נגד p-53. קווים מקווקווים מראים...