$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים המערבים בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת מטריצה חוץ-תאית לשון (TEM)
- הוציאו עכברים להורג על ידי פריקת צוואר הרחם והוציאו את הלשונות באמצעות מספריים כירורגיים סטריליים ופינצטה.
- לטבול את הלשונות באתנול 75% למשך 3 דקות, ולאחר מכן להכניס כל לשון לצינור אפנדורף (EP) 1.5 מ"ל עם 1 מ"ל של תמיסה סטרילית חוצצת פוספט (PBS).
הערה: ריכוז PBS בכל השלבים הבאים זהה לריכוז בשלב זה.
- ליזה של תאים על ידי הקפאה-הפשרה: הקפיאו את הלשונות בצינורות EP בטמפרטורה של -80°C למשך שעה ולאחר מכן הפשירו את הלשונות בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות למשך 3 מחזורים.
- יש להעמיס כל לשון על חתיכת תפר כירורגי באמצעות מחט כירורגית ולעטוף את קצה התפר בחתיכה קטנה של ציצית סטרילית. בצע את הפעולה בכלי תרבית בגודל 3.5 ס"מ או 6 ס"מ המכיל 75% אתנול בתנאים סטריליים.
הערה: האורך המתאים של כל חתיכת תפר כירורגי הוא כ-20 ס"מ, והגודל המתאים של כל חתיכת טינפויל הוא כ-0.3ס"מ 2 (1 ס"מ על 0.3 ס"מ). יש להעמיס את הלשון ליד הציפורן.
- יש לשטוף כל לשון ב-3 מ"ל PBS סטרילי בכלי תרבית בגודל 3.5 ס"מ או 6 ס"מ למשך 30 שניות. יש לבצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
- שטפו את הלשונות במים טהורים במיוחד: הוסיפו אמפיצילין לבקבוק רחב פה עם 250 מ"ל מים סטריליים אולטרה-טהורים לריכוז סופי של 90 מק"ג/מ"ל. הכניסו את הלשונות לבקבוק המכיל מוט ערבוב. הדקו את פקק הבקבוק כשחלק מהתפר נותר מחוץ לבקבוק. בצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
הערה: ניתן להכניס עד 5 לשונות לאותו בקבוק בהתחשב בטוויית התפר. הציצית נמצאת בקצה התפר בבקבוק כדי למנוע מהלשון להחליק. יש למקם את הלשונות בגובה 2 ס"מ מתחתית הבקבוק על ידי התאמת אורך התפר שנותר בתוך הבקבוק. הערה זו מתייחסת גם לשלבים 1.8, 1.10, 1.12 ו- 1.16.
- הניחו את הבקבוק על מערבל מגנטי למשך 12 שעות.
- שטפו את הלשונות עם NaCl: הוסיפו אמפיצילין לבקבוק רחב פה עם 250 מ"ל של 1 M NaCl סטרילי לריכוז סופי של 90 מיקרוגרם/מ"ל. העבירו את הלשונות ואת מוט הערבוב לתוך הבקבוק. הדקו את פקק הבקבוק כשחלק מהתפר נותר מחוץ לבקבוק. בצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
- הניחו את הבקבוק על מערבל מגנטי למשך 24 שעות.
- ליזה תאית של Triton X-100: הוסף אמפיצילין לריכוז סופי של 90 מיקרוגרם/מ"ל לבקבוק רחב פה עם 250 מ"ל של 2% טריטון X-100 סטרילי ב-PBS. העבירו את הלשונות ואת מוט הערבוב לתוך הבקבוק. הדקו את פקק הבקבוק כשחלק מהתפר נותר מחוץ לבקבוק. בצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
- הניחו את הבקבוק על מערבל מגנטי למשך 48 שעות.
- שטפו לשונות עם CaCl2/MgCl2: הוסיפו אמפיצילין לבקבוק רחב פה עם 250 מ"ל CaCl2/MgCl 2/MgClסטרילי של 5 מ"ל לריכוז סופי של 90 מיקרוגרם/מ"ל. העבירו את הלשונות ואת מוט הערבוב לתוך הבקבוק. הדקו את פקק הבקבוק כשחלק מהתפר נותר מחוץ לבקבוק. בצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
- הניחו את הבקבוק על מערבל מגנטי למשך 24 שעות.
- עיכול על ידי DNase: הוסף 1 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) לכל צינור EP. הוסף DNase לתוך HBSS בהתאמה לריכוז סופי של 300 מיקרומטר. העבר כל לשון לכל צינור EP, כאשר חלק מהתפר מחוץ לצינור. בצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
הערה: ודא שהחלק של התפר שנשאר בתוך הבקבוקים בשלבים הקודמים נשאר גם בתוך צינור ה- EP בשלב זה, וודא שהחלק של התפר שנשאר מחוץ לבקבוקים בשלבים הקודמים נשאר גם מחוץ לצינור ה- EP בשלב זה.
- יש לדגור על הלשונות בצינורות EP בטמפרטורה של 37°C למשך 24 שעות.
- שטפו את הלשונות עם PBS: הוסיפו אמפיצילין לבקבוק רחב פה עם 250 מ"ל PBS סטרילי לריכוז סופי של 90 מק"ג/מ"ל. העבירו את הלשונות ואת מוט הערבוב לתוך הבקבוק. הדקו את פקק הבקבוק כשחלק מהתפר נותר מחוץ לבקבוק. בצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
- הניחו את הבקבוק על מערבל מגנטי למשך 24 שעות.
- יש לאחסן את ה-TEM המוכן ב-PBS סטרילי בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.