Cryomilling של רקמה decellularized: טכניקה להשגת אבקת מטריצה תאית עדינה

תקציר

מקור: Kornmuller, A. et al. ייצור קצפים ומיקרו-נשאים חוץ-תאיים שמקורם במטריצה כפלטפורמות תרבית תאים ואספקה ספציפיות לרקמות. J. Vis. Exp. (2017)

בסרטון זה, אנו מציגים את הפרוטוקול לקבלת אבקת מטריצה חוץ-תאית טחונה דק מרקמה דה-צלולרית ליופילית על ידי הקפאה. אבקת ECM שומרת על הרכבה הביוכימי וניתן להשתמש בה לסינתזה של מיקרו-נשאים.

פרוטוקול

1. עיבוד רקמות דה-סלולריות

1. דה-צלולריזציה וליופיליזציה
   1. Decellularize רקמות מעניינות בעקבות פרוטוקול מבוסס.
      הערה: פיגומים במחקר הנוכחי הוכנו בעקבות פרוטוקולי דה-צלולריזציה שפורסמו עבור DAT אנושי, DDT חזירי ו-DLV חזירי. קולגן בלתי מסיס זמין מסחרית יכול לשמש גם לייצור קצף ומיקרו-נשאים, כגון קולגן שמקורו בגיד בקר, אשר שימש בהצלחה בטווח ריכוז של 10-50 מ"ג/מ"ל. ניתן להשתמש במקורות קולגן בלתי מסיסים אחרים, אך ייתכן שיהיה צורך לבצע אופטימיזציה כדי לזהות את טווח הריכוזים שיניב פיגומים יציבים.
   2. מעבירים את הרקמה הלא צלולרית או הקולגן המטוהר לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל עם מלקחיים ומוסיפים מספיק מים מזוקקים כפול (ddH₂O) כדי לטבול את הרקמה, לנפח כולל מרבי של 35 מ"ל.
   3. הקפיאו את הדגימה למשך הלילה בטמפרטורה של -80°C, כאשר צינור הצנטריפוגה ממוקם אופקית במהלך ההקפאה כדי למקסם את שטח הפנים לסובלימציה במהלך ליופיליזציה לאחר מכן.
   4. הסר את הפקק מצינור הצנטריפוגה והעבר את הדגימה הקפואה לצנצנת ליופיליזציה.
   5. ליופיליזציה של הדגימה באמצעות מייבש הקפאה במעבדה למשך 48-72 שעות או עד לייבוש מלא.
      הערה: זמן הייבוש עשוי להשתנות עבור lyophilizers שונים ורקמות decellularized.
   6. לטחון דק את ECM lyophilized לחתיכות קטנות (~ 1-2 מ"מ³) באמצעות מספריים כירורגיים חדים.
   7. אחסן את ה- ECM הטחון במייבש עד שיהיה מוכן לעיבוד נוסף.
      הערה: מומלץ להשתמש ב-ECM הטחון באופן מיידי כדי למנוע ספיגת לחות מהסביבה.
2. Cryomilling (אופציונלי לייצור קצף)
   1. מלא תא כרסום נירוסטה 25 מ"ל עבור מערכת טחנת כדורי מעבדה עם ECM lyophilized טחון והוסף שני כדורי כרסום נירוסטה 10 מ"מ.
   2. סגור וטבול לחלוטין את תא הכרסום הטעון בחנקן נוזלי למשך 3 דקות.
   3. טחנו את הדגימה הקפואה במשך 3 דקות ב-30 הרץ (1,800 סל"ד).
   4. חזור על שלבים 1.2.2 ו- 1.2.3 עד לטחינת ה- ECM לאבקה דקה.
      הערה: מספר הפעמים שיש לחזור על שלבים אלה עשוי להשתנות בין מקורות ECM. לדוגמה, DAT דורש בדרך כלל 3 מחזורי כרסום כדי לייצר אבקה דקה.
   5. מעבירים את האבקה בעזרת כף מדידה לבקבוקון זכוכית, אוטמים היטב ומאחסנים במייבש.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
לידים של קליפ אליגטור	VWR	470149-728
רדיד אלומיניום	פישר סיינטיפיק	01-213-101
איזון אנליטי	סרטוריוס	CPA225D
מערכת Cryomilling	רטש	20.745.0001	מ"מ 400
Dessicator	פישר סיינטיפיק	8624426	עבור ECM lyophilized ואחסון פיגומים ביולוגיים
בקבוק דיואר	פישר סיינטיפיק	10-196-6	צורה נמוכה; טווח נפח של 250 - 500 מ"ל
מים מזוקקים פעמיים (ddH2O)			מבית Barnstead GenPure מערכת טיהור מים xCAD
ECM (מטריצה חוץ-תאית)			מבודד מרקמת שומן אנושית, דרמיס חזירי או שריר לב חזירי, כמתואר בפלין ואחרים 2010, Reing et al. 2010, Wainwright et al. 2010
מלקחיים	VWR	37-501-32	להעברת הקצפים
מקפיא (-20°C)	VWR	97043-346
מקפיא ( -80 מעלות צלזיוס)	תרמו סיינטיפיק	EXF40086A
בקבוקוני זכוכית	פישר סיינטיפיק	03-339-26D	כדי לאחסן ECM cryomilled lyophilized
חנקן נוזלי			לריסוס חשמלי
ליופיליזר	לבקונקו	7750021	FreeZone4.5
תא כרסום	רטש	02.462.0213	נפח 25 מ"ל מומלץ
כדורי כרסום	VWR	16003-606	קוטר 10 מ"מ, נירוסטה מומלצת
פניצילין-סטרפטומיצין	לייף טכנולוגיות	15140-122	משמש להפצת מדיה
Pipet-Aid XP	מנדל סיינטיפיק	DRU-4-000-101
סקופולה	VWR	89259-968	לאיסוף מיקרו-נשאים
מספריים כירורגיים	VWR	82027-590