הכנת השעיית ECM: טכניקה להשגת תרחיף הומוגני ממטריצה חוץ-תאית שמקורה ברקמה

תקציר

מקור: Kornmuller, A. et al. ייצור של קצפים ומיקרו-נשאים חוץ-תאיים שמקורם במטריצה כפלטפורמות תרבית תאים ואספקה ספציפיות לרקמות. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מתאר את הכנת תרחיף מטריצה חוץ-תאי הומוגני ומעוכל מרקמות דה-צלולריות וליופיליות. טכניקה זו מסייעת בייצור קצפים נקבוביים ומיקרו-נשאים שמקורם ב-ECM לשימוש כמצעים במודלים מתקדמים של תרביות תאים תלת-ממדיות.

פרוטוקול

1. עיבוד רקמות דה-סלולריות

1. דה-צלולריזציה וליופיליזציה
   1. Decellularize רקמות מעניינות בעקבות פרוטוקול מבוסס.
      הערה: פיגומים במחקר הנוכחי הוכנו בעקבות פרוטוקולי דה-צלולריזציה שפורסמו עבור רקמת שומן דה-צלולרית אנושית (DAT), רקמת עור חזירית דה-צלולרית (DDT) וחדר שמאל חזירי דה-צלולרי (DLV). קולגן בלתי מסיס זמין מסחרית יכול לשמש גם לייצור קצף ומיקרו-נשאים, כגון קולגן שמקורו בגיד בקר, אשר שימש בהצלחה בטווח ריכוז של 10-50 מ"ג/מ"ל. ניתן להשתמש במקורות קולגן בלתי מסיסים אחרים, אך ייתכן שיהיה צורך לבצע אופטימיזציה כדי לזהות את טווח הריכוזים שיניב פיגומים יציבים.
   2. מעבירים את הרקמה הלא צלולרית או הקולגן המטוהר לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל עם מלקחיים ומוסיפים מספיק מים מזוקקים כפול (ddH₂O) כדי לטבול את הרקמה, לנפח כולל מרבי של 35 מ"ל.
   3. הקפיאו את הדגימה למשך הלילה בטמפרטורה של -80°C, כאשר צינור הצנטריפוגה ממוקם אופקית במהלך ההקפאה כדי למקסם את שטח הפנים לסובלימציה במהלך ליופיליזציה לאחר מכן.
   4. הסר את הפקק מצינור הצנטריפוגה והעבר את הדגימה הקפואה לצנצנת ליופיליזציה.
   5. ליופיליזציה של הדגימה באמצעות מייבש הקפאה במעבדה למשך 48-72 שעות או עד לייבוש מלא.
      הערה: זמן הייבוש עשוי להשתנות עבור lyophilizers שונים ורקמות decellularized.
   6. טחון דק את ECM lyophilized לחתיכות קטנות (~ 1-2 מ"מ³) באמצעות מספריים כירורגיים חדים.
   7. אחסן את ה- ECM הטחון במייבש עד שיהיה מוכן לעיבוד נוסף.
      הערה: מומלץ להשתמש ב-ECM הטחון באופן מיידי כדי למנוע ספיגת לחות מהסביבה.
2. קריומילינג
   1. מלא תא כרסום נירוסטה 25 מ"ל עבור מערכת טחנת כדורי מעבדה עם ECM lyophilized טחון והוסף שני כדורי כרסום נירוסטה 10 מ"מ.
   2. סגור וטבול לחלוטין את תא הכרסום הטעון בחנקן נוזלי למשך 3 דקות.
   3. טחנו את הדגימה הקפואה במשך 3 דקות ב-30 הרץ (1,800 סל"ד) לאבקה דקה.
      הערה: מספר הפעמים שיש לחזור על שלבים אלה עשוי להשתנות בין מקורות ECM. לדוגמה, DAT דורש בדרך כלל 3 מחזורי כרסום כדי לייצר אבקה דקה.
3. הכנת השעיית ECM
   1. לשקול 250 מ"ג של ECM טחון (עבור קצף) או cryomilled (עבור קצף או microcarriers) ECM ולהעביר אותו לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. עיין בשלב 1.1.6 ובסעיף 1.2 להכנת ECM טחון ו- ECM בהקפאה, בהתאמה.
      הערה: פרוטוקול זה נועד להכין תרחיף ECM של 50 מ"ג/מ"ל, המומלץ עבור DAT אנושי, DDT חזירי ו- DLV חזירי. בהתאם למקור ECM הספציפי, מתלים אחידים עשויים להיווצר בריכוזי התחלה גבוהים או נמוכים יותר.
   2. הוסף 5 מ"ל של חיץ 0.22 M NaH₂PO₄ (pH 5.4) לצינור הצנטריפוגה וסמן את רמת הנוזל על הצינור.
   3. הכינו תמיסת מלאי α-עמילאז על ידי הוספת 7.5 מ"ג של α-עמילאז למאגר של 1 מ"ל 0.22 M NaH₂PO₄ (pH 5.4). הוסף 100 μL של תמיסת מלאי α-עמילאז (0.75 מ"ג של α-עמילאז: 0.3% w / w של רקמה יבשה) לדגימה. הוסף 0.22 M NaH₂PO₄ כדי לקבל נפח סופי של 10 מ"ל.
   4. יש להסעיר את המתלים ברציפות ב-300 סל"ד למשך 72 שעות בטמפרטורת החדר.
   5. צנטריפוגו את המתלה במהירות של 1,500 x גרם למשך 10 דקות. אספו בזהירות את הסופרנאטנט והשליכו אותו מבלי להפריע לכדורית ECM המעוכלת. להשהות מחדש את החומר הכדורי ב 10 מ"ל של 5% NaCl מדולל ddH₂O.
   6. חזור על שלב 1.3.5 עבור שתי שטיפות בסך הכל עם 5% NaCl ב- ddH₂O.
   7. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את החומר הכדורי ב-10 מ"ל של ddH₂O.
   8. הפעל את המתלים ברציפות ב-300 סל"ד למשך 10 דקות ב-RT.
   9. צנטריפוגו את המתלה במהירות של 1,500 x גרם למשך 10 דקות. אספו בזהירות את הסופרנאטנט והשליכו אותו מבלי להפריע לכדורית ECM המעוכלת.
   10. הוסף 0.2 M חומצה אצטית לסימן 5 מ"ל שנעשה בשלב 1.3.2.
   11. הפעל את המתלים ברציפות ב-120 סל"ד O/N ב-37°C.
   12. הומוגניזציה של מתלה ECM בטמפרטורת החדר במרווחים של 10 שניות באמצעות הומוגנייזר ידני המצויד בבדיקה ברוחב 10 מ"מ עד שלא נותרו שברים נראים לעין. הניחו את המתלה בתוך מים קרים בין מרווחי ההומוגניזציה כדי למנוע התחממות יתר.
       הערה: בהתאם למקור ECM, דילול נוסף בחומצה אצטית 0.2 M עשוי להידרש כדי להשיג השעיה הומוגנית. קירור מוגזם של מתלה ECM עלול לגרום לעלייה בצמיגות שעלולה להפריע להומוגניזציה יעילה. אם עלייה צמיגות הוא ציין, הדגימה ניתן לחמם מחדש ל 37 °C (77 °F) נתון לעיבוד נוסף.
   13. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד חודש לפני ייצור קצף או מיקרו-נשא.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חומצה אצטית, קרחונית	ביושופ	ACE222.5
α-עמילאז	סיגמא	101074694	מ Aspergillus aryzae
75004251 צנטריפוגות	תרמו סיינטיפיק		עם רוטור דלי מתנדנד עבור צינורות צנטריפוגות 15 ו -50 מ"ל
צינורות צנטריפוגה (15 מ"ל)	זארשטדט	62.554.205
Dessicator	פישר סיינטיפיק	8624426	עבור ECM lyophilized ואחסון פיגומים ביולוגיים
מים מזוקקים פעמיים (ddH2O)			מבית Barnstead GenPure מערכת טיהור מים xCAD
ECM (מטריצה חוץ-תאית)			מבודד מרקמת שומן אנושית, דרמיס חזירי או שריר לב חזירי, כמתואר ב Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, ו Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
הומוגנייזר ידני	פישר סיינטיפיק	14-359-251	מהירות: 8,000 - 30,000 סל"ד
אביזרי הומוגנייזר: בדיקות מחולל תחתית שן מסור	פישר סיינטיפיק	14-261-17	10 x 95 מ"מ
חנקן נוזלי
נתרן כלורי	ביושופ	7647-14-5
נתרן פוספט מונובייסיק	ביושופ	10049-21-5
מספריים כירורגיים	VWR	82027-590