ייצור קצף חוץ-תאי באמצעות ליופיליזציה: הליך ליצירת פיגומים ביולוגיים מ-ECM של רקמות דה-צלולריות

תקציר

מקור: Kornmuller, A. et al. ייצור קצפים ומיקרו-נשאים חוץ-תאיים שמקורם במטריצה כפלטפורמות תרבית תאים ואספקה ספציפיות לרקמות. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מתאר את השיטה לסינתזה של קצפים טהורים שמקורם ב-ECM ללא צורך בהצלבה כימית. קצפים אלה שמקורם ב-ECM מוצאים יישומים כמודלים מתקדמים של תרביות תאים במבחנה תלת-ממדית או כפיגומים ביולוגיים פרו-רגנרטיביים.

פרוטוקול

1. ייצור קצף נגזר ECM

1. הכן את מתלה ECM הומוגני על ידי פיזור אבקה דקה ECM בתמיסת חיץ ודגרה ב 37 ° C עם תסיסה מתמשכת ב 120 סל"ד עד המתלים חמים.
2. לדלל את תרחיף ECM ב 0.2 M חומצה אצטית לריכוז הרצוי.
   הערה: בהתאם למקור ECM, ניתן להכין קצפים יציבים בטווח של 10-100 מ"ג/מ"ל, כאשר 15-50 מ"ג/מ"ל הם הטווח המומלץ עבור DAT, DDT ו-DLV. בדרך כלל, קצף המיוצר בריכוזים גבוהים יותר יהיה מעט פחות נקבובי אך יציב יותר בתרבית וקל יותר לטפל בו.
3. באמצעות מזרק 3 מ"ל עם מחט 18G כדי למנוע היווצרות בועות בהשעיה ECM, למלא את התבנית הרצויה עם השעיית ECM. כדי לייצר את קצפי ה-DAT, הדי.די.טי וה-DLV, יש לפזר 400 μL של תרחיף ECM במינון 35 מ"ג/מ"ל לתוך צלחת בת 48 בארות שטופלה בתרבית תאים.
   הערה: צורת התבנית שנבחרה ונפח השעיית ECM יקבעו את הגיאומטריה של הקצף המתקבל.
4. מכסים ומקפיאים את התבניות למשך הלילה על ידי הכנסתן למקפיא -20°C או -80°C.
   הערה: טמפרטורת הקיפאון עלולה להשפיע על נקבוביות הקצף. נקבוביות גדולות יותר צפויות כאשר הדגימות מוקפאות ב -20 ° C לעומת -80 ° C עקב היווצרות גבישי קרח גדולים יותר. כדי לייצר קצף בעל מבנה נקבובי אחיד, יש לוודא שהתבנית אינה באה במגע עם משטח מוליך למניעת קירור כיווני.
5. מניחים את התבניות המכילות את הדגימות הקפואות לתוך בקבוק ליופיליזר. חבר את בקבוק הליופיליזר למערכת מייבש ההקפאה במעבדה וייבוש למשך 24 שעות
   הערה: חשוב שהדגימה תישאר קפואה לפני ליופיליזציה.
6. אחסנו את הקצפים הליופיליים במייבש עד לצורך.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
איזון אנליטי	סרטוריוס	CPA225D
צינורות צנטריפוגה (15 מ"ל)	זארשטדט	62.554.205
צינורות צנטריפוגה (50 מ"ל)	זארשטדט	62.547.205
קולגן מאכילס בקר גיד (בלתי מסיס)	סיגמא	C9879	או קולגן בלתי מסיס דומה מקור; יכול לשמש כ- an חלופה ל- decellularized רקמות לייצור הקצף ו מיקרו-נשאים
Dessicator	פישר סיינטיפיק	8624426	עבור ECM lyophilized ו אחסון פיגומים ביולוגיים
בקבוק דיואר	פישר סיינטיפיק	10-196-6	צורה נמוכה; טווח נפח של 250 -500 מ"ל
מים מזוקקים פעמיים (ddH_{2} O)			מ- Barnstead GenPure xCAD מערכת טיהור מים
D-PBS (פוספט-חוצץ מלח)	וויסנט	311425125
ECM (מטריצה חוץ-תאית)			מבודד משומן אנושי רקמות, דרמיס חזירי או porcine שריר הלב, כמתואר ב- Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
מלקחיים	VWR	37-501-32	להעברת הקצפים
מקפיא (-20°C)	VWR	97043-346
מקפיא ( -80 מעלות צלזיוס)	תרמו סיינטיפיק	EXF40086A
בקבוקוני זכוכית	פישר סיינטיפיק	03-339-26D	כדי לאחסן lyophilized cryomilled ECM
חנקן נוזלי			לריסוס חשמלי
ליופיליזר	לבקונקו	7750021	FreeZone4.5
18 גר' מחט	VWR	ג ABD305185	לניפוק השעיית ECM לתוך תבניות
מנער אינקובטור אורביטלי	SciLogex	832010089999	טמפרטורה מבוקרת (37°C)
פיפטות סרולוגיות (10 מ"ל)	זארשטדט	86.1254.001
פיפטות סרולוגיות (25 מ"ל)	זארשטדט	86.1685.001
נתרן כלורי	ביושופ	7647-14-5
נתרן פוספט מונובייסיק	ביושופ	10049-21-5