מאמר שיטה

ייצור פיגומים ביולוגיים על ידי התזה חשמלית: טכניקה ליצירת פיגומים מיקרו-נשאיים שמקורם במטריצה חוץ-תאית של רקמה דה-צלולרית

30 באפריל 2023

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Kornmuller, A. et al. ייצור של קצפים ומיקרו-נשאים חוץ-תאיים שמקורם במטריצה כפלטפורמות תרבית תאים ואספקה ספציפיות לרקמות. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את ההליך של ייצור מיקרו-נשא חוץ-תאי שמקורו במטריצה על ידי התזה חשמלית. מיקרו-נשאים אלה מדמים את המיקרו-סביבה הספציפית לרקמה המקומית והם יציבים במודלים ארוכי טווח של תרביות תאים במבחנה תלת-ממדית.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור מיקרו-נשאים נגזר ECM באמצעות Electrospraying

הערה: סקירה כללית של מערך הריסוס החשמלי מוצגת באיור 1.

  1. יש לדגור על מתלה ECM שהוכן בעבר בהקפאה ב-37°C עם תסיסה מתמשכת ב-100 סל"ד O/N.
    הערה: Cryomilled ECM משמש לייצור מיקרו-נשאים שמקורם ב-ECM כדי להבטיח אחידות רבה יותר בתרחיף ולמנוע סתימה במהלך ריסוס חשמלי.
  2. יש להעמיס 3 מ"ל של מתלה ECM לתוך מזרק Luer-Lock של 3 מ"ל ולחבר מערכת עירוי מכונפת על משענת המזרק.
    הערה: ניתן להשתמש במגוון מדי מחטים, תוך הכרה בכך שהבחירה עשויה להשפיע על גודלם וצורתם של המיקרו-נשאים המתקבלים. כדי לייצר את המיקרו-נשאים DAT, DDT ו-DLV, השתמש במחט 25G.
  3. אבטחו את המזרק בתוך משאבת המזרק. הדקו את המחט למעמד תגובה ומקמו את קצה המחט במאונך במרחק של 4–6 ס"מ מראש בקבוק דיואר נמוך (מומלץ טווח מידות של 250–500 מ"ל).
  4. חבר אלקטרודת קליפ תנין לקצה המחט וחבר אותה למסוף החיובי של ספק הכוח במתח גבוה.
  5. קפלו רצועה של רדיד אלומיניום (12X5 ס"מ) על קצה בקבוק הוואקום.
  6. חבר אלקטרודת קליפס תנין שנייה לקצה החיצוני של נייר הכסף וחבר אותה למסוף מקור הקרקע של ספק הכוח.
  7. ממלאים את בקבוק הדיואר בחנקן נוזלי עד כ-1 ס"מ מהחלק העליון, כך ש-3/4 מנייר הכסף שקוע.
    הערה: חשוב לשמור על בקבוק דיואר מלא בחנקן נוזלי. פני השטח של החנקן הנוזלי לא צריכים להיות פחות מ -2 ס"מ מראש הבקבוק במהלך תהליך הריסוס החשמלי. מילוי רציף של החנקן הנוזלי נדרש כדי לשמור על רמה קבועה במהלך הריסוס החשמלי.
  8. הגדר את משאבת המזרק לקצב עירוי של 30 מ"ל / שעה.
    הערה: שינוי קצב העירוי יכול לשנות את צורת המיקרו-נשא ואת קוטרו, אך הטווח המומלץ הוא 25-35 מ"ל/שעה. למרות שהוא תלוי מאוד בצמיגות המתלים, קצבי זרימה מתחת ל-25 מ"ל/שעה עלולים לגרום ליצירת מיקרו-נשאים גדולים יותר. בספיקות נמוכות מאוד, הגודל והצורה של המיקרו-נשאים עשויים להיות פחות הומוגניים. בקצבי עירוי מעל 35 מ"ל/שעה, אחידות הטיפות הנוצרות באמצעות התזה חשמלית עלולה להיות משובשת, וכתוצאה מכך מיקרו-נשאים לא כדוריים עם פיזור גודל רחב יותר.
  9. החל מתח של 20 kV והפעל את משאבת המזרק כדי ליזום electrospraying.
    הערה: המתח עשוי להיות שונה כדי לכוונן את גודל המיקרו-נשאים ונוטה להשפיע יותר על הקוטר מאשר קצב העירוי. טווח המתח המומלץ הוא 15–25 קילו וולט. צפויה ירידה בקוטר המיקרו-נשא עם עלייה במתח.
  10. לאחר השלמת העירוי, שפכו בזהירות עודפי חנקן נוזלי מהדיואר, והותירו את המיקרו-נשאים מרחפים ב~25 מ"ל של חנקן נוזלי כדי להבטיח שהם יישארו קפואים.
  11. מיד להעביר את microcarriers עם חנקן נוזלי לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל על ידי מזיגה בתנועה חלקה אחת. אספו את כל המיקרו-נשאים הקפואים שנותרו בדיואר עם סקופולה והוסיפו אותם לצינור הצנטריפוגה.
    הערה: בהתאם לגודל של דיואר, microcarriers בחנקן נוזלי ניתן בתחילה לשפוך לתוך כלי בגודל בינוני ולאחר מכן מועבר מיד לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
  12. מכסים את צינור הצנטריפוגה המכיל את המיקרו-נשאים בחנקן נוזלי ברדיד אלומיניום מחורר בחורים קטנים כהכנה לליופיליזציה.
  13. מניחים את צינורות הצנטריפוגה המכוסים בבקבוק ליופיליזר. מיד לחבר את הבקבוק lyophilizer ולייבש את הדגימות O/N.
    הערה: חשוב מאוד לשמור על המיקרו-נשאים מרחפים בחנקן נוזלי כדי להבטיח שהם לא יפשירו לפני שלב זה, שכן הפשרה עלולה לגרום לקריסה ו/או צבירה. מיקרו-נשאים של DAT, DDT ו-DLV המיוצרים בריכוז של 35 מ"ג/מ"ל תוך שימוש בתנאי הריסוס החשמלי שתוארו לעיל יהיו בדרך כלל בעלי קוטר לח הנע בין 350-500 מיקרומטר. התפלגות הגודל עשויה להשתנות בהתאם למקור ECM.
  14. אחסנו את המיקרו-נשאים הליופיליים במייבש עד לצורך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1. סקירה כללית של מנגנון electrospraying המשמש לייצור microcarrier. ת: תמונה המציגה את סידור ציוד ההתזה החשמלי העיקרי כולל משאבת המזרק וספק הכוח במתח גבוה, כמו גם את מיקום המחט ביחס לדיואר של חנקן נוזלי. B: סכמת אלקטרוספריי, כולל הטווחים המומלצים למתח, קצב העירוי, ומרחק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
לידים של קליפ אליגטורVWR470149-728
רדיד אלומיניוםפישר סיינטיפיק01-213-101
צינורות צנטריפוגה (15 מ"ל)זארשטדט62.554.205
צינורות צנטריפוגה (50 מ"ל)זארשטדט62.547.205
Dessicator פישר סיינטיפיק 8624426 עבור ECM lyophilized ואחסון פיגומים ביולוגיים
בקבוק דיוארפישר סיינטיפיק10-196-6צורה נמוכה; טווח נפח של 250 - 500 מ"ל
ECM (מטריצה חוץ-תאית)מבודד מרקמת שומן אנושית, דרמיס חזירי או שריר לב חזירי, כמתואר ב Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, ו Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
חנקן נוזלילריסוס חשמלי
ליופיליזרלבקונקו7750021FreeZone4.5
מנער אינקובטור אורביטליSciLogex8.3201E+11טמפרטורה מבוקרת (37°C)
עמדת תגובהVWR470019-526
מהדק מעמד תגובהVWR21573-606
מזרק בטיחות-לוקב.ד.309606מזרק מנעול Luer 3 מ"ל לייצור מיקרו-נשא וניפוק מתלה ECM
סקופולהVWR89259-968לאיסוף מיקרו-נשאים
משאבת מזרקVWR10117-490מיקרו-מעבד נשלט
ספק כוח מתח גבוהמחקר גמא מתח גבוהES30P-5W/DDPMמסוגל לטווח מתח מומלץ של 15 - 25 קילו וולט
סט עירוי מכונףתרומו22258092אורך צינורות 30 ס"מ, מומלץ 25 גרם 3/4 אינץ'; ניתן להשתמש במדי מחטים אחרים ועשויים להשפיע על קוטר המיקרו-נשא

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים