כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת טיפות מטריצה מוצקות למחצה (< דקה לצלחת)
- הניחו צלחת זכוכית צוננת מראש על גוש קרח מתחת למיקרוסקופ ההפעלה. ודא שהאליקוט של המטריצה נשאר על הקרח בכל עת.
- מניחים טיפת מטריצה של 1.5 μL בכל אחת מארבע הפינות של הצלחת התחתונה עם מיקרופיפטר 2 μL או 10 μL, ומשאירים מרחק גדול לפחות כמו הטיפה עצמה מקצה הבאר.
- הניחו את קצה הפיפטה ישירות על הזכוכית בזווית של 45 מעלות. לאט לאט פיפטה את המטריצה. התרחקו לאט מתחתית הזכוכית לאחר שהמטריצה מעורבת בצלחת.
הערה: מתח הפנים בין המטריצה לזכוכית אמור ליצור חצי כדור מושלם בכל פעם.
- הפסיקו את הצנרת רגע לפני שהקצה מתרוקן מכיוון שהזרקה לא מכוונת של אוויר לטיפת המטריצה הופכת את קוטר טיפת המטריצה לגדול הרבה יותר וקשה להסירה.
הערה: שימוש ביד שנייה לייצוב היד הכורעת מאפשר מיקום מדויק יותר.
2. הכנסת DRG לטיפות מטריצה מוצקות למחצה (< 2 דקות לצלחת)
- השאירו את הצלחת עם טיפות המטריצה לזמן קצר בטמפרטורת החדר (~ 1 דקות). זה מקשיח מעט את המטריצה, מה שמקל על המיקום המדויק של DRG.
- יש לאחוז (לא לתפוס) את ה-DRG בעדינות עם מלקחיים מיקרוסקופיים סגורים ביד שמאל. שוב, רקע כהה על רקע DRG קטן ולבן מאפשר תצוגה חזותית. העבירו את ה-DRG לקצה מחט 21G ביד ימין. העברה זו תשאיר שאריות מדיה על המלקחיים.
- הכניסו בעדינות את ה-DRG למרכז טיפת המטריצה באמצעות מחט 21G (איור 1). רוב הזמן, DRG ישתחרר בקלות לתוך המטריצה ולאחר מכן ניתן למקם אותו במרכז עם המחט.
- אם ה-DRG נדבק למחט, השתמש במלקחיים מיקרוסקופיים כדי לדחוף את ה-DRG מהמחט אל תוך טיפת המטריצה. יש לסלק את עודפי המדיה מהמלקחיים המיקרוסקופיים בעזרת מגבון מעבדה.
הערה: הכנסת מדיה למטריצה תשנה את הקוטר, הנפח והעקביות של הבדיקה. גוש קרח עם כיתוב צבעוני או צבעוני מספק ניגודיות רקע, מה שמקל על הדמיה של תהליך עדין זה.
- לאחר שבלוח יש את כל ארבעת ה- DRGs, בצע בדיקה סופית כדי לוודא שה- DRG נמצא במרכז טיפת המטריצה. בצע התאמות לפי הצורך עם מחט 21G.
- מעבירים את הצלחת השלמה לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C. זה יהיה לחזק את המטריצה מוצק למחצה לתקן את DRG במיקום.
- חזור על תהליך זה עבור כל ה- DRGs. מקם טיפות מטריצה ריקות ללא DRG כבקרה השלילית.
- הוסף 4 מ"ל DMEM עם מדיה של 10% FBS לכל צלחת תחתית זכוכית לאחר השלמת כל הלוחות וחשיפתם לאינקובטור של 37 ° C למשך 3 דקות לפחות. מניחים את הצלחת בזווית קלה ומוסיפים לאט לאט את המדיום, כך שהוא בא במגע בהדרגה עם יחידות המטריצה-DRG.
הערה: אם מוסיפים את המדיום מהר מדי או במרץ, המטריצה ו/או ה-DRG עלולים להתנתק.
- אחסן את הבדיקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עבור 48-72 h.
הבאים
הערה: בדיקה תקופתית של הבדיקות תראה צמיחה היקפית של נוירוטים לכיוון קצה המטריצה (איור 2). כאשר הנוירוטים גדולים משלושת רבעי הדרך למטריצה, ראוי לצלחת את התאים.
3. הכנת תאי סרטן הראש והצוואר
הערה: ניתן להשתמש בקווי תאים שאינם תאי קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר בתכנון ניסוי זה.
- שמור על קווי תאי קרצינומה של תאי קשקש ב- DMEM עם 10% FBS בצלוחיות מועדפות או בצלחות תרבית באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. כדי להכין תאים לניסויים, יש לשאוב את כל המדיום מבקבוק התרבית או מהצלחת ולשטוף אותו פעמיים עם PBS. להשעות את התאים על ידי הוספת כמות מתאימה של 0.025% טריפסין במשך 5 דקות, ואחריו DMEM עם 10% FBS. פיפטה 4 מ"ל של התא ואת תערובת המדיה לתוך 6 מ"ל צלחת תרבית.
הערה: צלחת תרבית של 6 מ"ל מספקת די והותר תאים, גם כאשר פחות מ-50% מהם נפגשים.
- יש לחשוף את קווי התאים של HNSCC לתנאים שונים 24 שעות לפני הצביעה והציפוי בבדיקת DRG. מינון מחדש של המצב ברגע שהתאים מצופים כדי לשמור על סביבה עקבית.
הערה: הוסף נוגדנים, גורמי גדילה, ציטוקינים או מולקולות אחרות לצלחות תרבית התא 1-2 ימים לאחר נתיחת העכבר והשתלת DRG לתוך המטריצה.
- מוסיפים כתמי תאים פלואורסצנטיים שעה לפני ציפוי התאים (2-3 ימים לאחר קציר DRG והשתלה במטריצה).
הערה: הכתמים המסוימים המשמשים כאן עוברים בחופשיות דרך קרום התא; עם זאת, לאחר תגובה עם קבוצות תיול תוך-תאיות, הכתם נשאר בתוך התא ומועבר לתאי בת. הצביעה מקלה מאוד על ההדמיה בתוך המבחנים. כתמים זמניים אלה אידיאליים עבור בדיקות אלה מכיוון שהפלואורסצנטיות קיימת במשך 2-3 ימים, שהיא מסגרת הזמן של ניסויים אלה. זה גם מאפשר שימוש בצבעים רבים ושונים ומייתר את הצורך ביצירת קווי תאים נגועים בחלבון פלואורסצנטי.
- הכן 10 מיקרומטר של תמיסת צבע על ידי ערבוב 2 μL של כתמי תאי מלאי של 10 mM ב- 2 מ"ל DMEM ללא סרום לכל מצב תא. חממו אותו ל-37°C לפני הוספתו לתאים.
- הסר את מדיום התרבית בתוך צלחת 6 מ"ל, משאיר את תאי HNSCC דבק על הצלחת. הוסף 2 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) והסר 2 מ"ל של 10 μM DMEM ללא כתמים/סרום שנוסף לכל לוחית.
- החזירו את צלחת התרבית 6 מ"ל עם כתם התא לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.
- אחרי 40 דקות, שאפו את המדיום. הוסף 2 מ"ל של PBS ולאחר מכן לשאוף אותו. הוסף 1 מ"ל של 0.025% טריפסין לכל צלחת והחלף אותם באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
- הוסף 2 מ"ל DMEM עם 10% FBS לאחר 3-5 דקות והעבר את התאים המרחפים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. סובב את התאים והשהה אותם מחדש ב 1 מ"ל של DMEM עם 10% FBS.
- ספור את התאים עם hemocytometer או מונה תאים אוטומטי ולאחר מכן להוסיף DMEM עם 10% FBS כדי ליצור ריכוז תאים סופי של 300,000 תאים לכל מ"ל.
4. ציפוי תאי סרטן ראש וצוואר
- הסר את לוחות תחתית הזכוכית עם מבחני מטריצה-DRG מהאינקובטור.
הערה: שוב, הם מתאימים כאשר נוירוטים נמצאים לפחות 75% מהדרך לקצה המטריצה, אשר מתרחשת בדרך כלל לאחר 2-3 ימים. הדרך הטובה ביותר לראות זאת היא באמצעות מטרה של פי 10 לפחות.
- שאפו את המדיום בתוך הצלחת בעלת תחתית הזכוכית. שאפו לחלוטין את המדיום בתוך הזכוכית היטב מבלי להסיר את יחידות המטריצה-DRG.
- צייר 200 μL מתוך 300,000 תאים / mL תווך באמצעות פיפטה 200 μL. הניחו שתי טיפות של התאים מעל כל בדיקת מטריצה-DRG. בצע שלב זה עבור כל טיפת מטריצה, וצור ארבע חזרות של כל תנאי תא על לוח אחד.
הערה: הצורה ההמיספרית של המטריצה מאפשרת לתאים להתיישב בטבעת לאורך הפריפריה של הבדיקה (איור 3a, איור 3b). מציאת פיפטה עם הדק חלק הופכת את מיקום הטיפות האחידות להרבה יותר קל.
- אשר מספרי תאים דומים והתפלגות של תנאי התא השונים תחת מיקרוסקופ 4X.
- הכניסו את לוחות הזכוכית התחתונים לאינקובטור של 37°C למשך כ-60 דקות.
הערה: למרות שיש רק נפח קטן של תאים ומדיה (~ 150 μL), הבדיקות אינן מתייבשות עד שחלפו מספר שעות של זמן אינקובטור.
- לאחר 60 דקות, הוסף בעדינות 4 מ"ל DMEM עם 10% FBS לאורך הדופן של צלחת תחתית הזכוכית.
הערה: לאורך זמן, התאים נצמדים חלקית לתחתית הצלחת, ושיטת הוספת המדיום אינה מפריעה לתאים. סוגי תאים שונים עשויים לקחת פחות או יותר זמן כדי להתחיל להיצמד לצלחת תחתית הזכוכית.
- החלף תרופות אקסוגניות או גורמי גדילה בשלב זה כדי לשמור על רמות הריכוז הקודמות.
- החזירו את הבדיקות לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, למעט כאשר הן נבדקות מיקרוסקופית. כמת את התוצאות של בדיקה זו על ידי הדמיה מיקרוסקופית. בקצרה, ספרו את גדילי הפלישה הפריעצבית בתוך ארבעה רבעים באמצעות תמונה מיקרוסקופית פי 4.
הערה: מיקרוסקופ בעל מטרה 4X ויכולות פלואורסצנטיות מתאים לתיעוד הצילומים של הבדיקות. גודל הבדיקות מתאים יפה לשדה של מטרה 4X, שהיא מפורטת מספיק כדי ללכוד את האזורים הבודדים של פלישה פרינוירלית. פלישה פריעצבית מתגלה תוך 24 שעות, אך מעבר ל -48 שעות, שלמות הבדיקות מתחילה להיחלש, כאשר תאי הגידול מתחלקים לאורך שולי המטריצה ופולשים. מעבר ל-48 שעות, יש גם שטף משמעותי של פיברובלסטים מה-DRG, שמטשטש את ההדמיה באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. לכן, מומלץ לתעד את התוצאות במיקרוסקופ 4X לפחות פעמיים במהלך חלון זה (למשל, ב-24 ו-48 שעות לאחר ציפוי תאי הגידול). שימו לב שמדובר בבדיקות תלת מימדיות, וקשה לדמיין לחלוטין את כל הבדיקה. רוב הפלישה הפרי-עצבית מתרחשת במישור מתחתית הצלחת, שבו התאים מוטמעים במטריצה מעט מעל תחתית הצלחת. מכיוון שמישור זה קרוב לאופקי, הרוב המכריע של תאי העצב עם תאי הגידול נלכדים בתמונה ברמה אחת ב- 4X.
