Cancer Side Population Discrimination Assay: שיטה לבידוד תאים סרטניים דמויי גזע באמצעות Hoechst Dye Efflux Assay

תקציר

מקור: Gilormini, M. et al. בידוד ואפיון תת-אוכלוסיית תאי קשקש בראש ובצוואר בעלת מאפיינים של תאי גזע. J. Vis. Exp. (2016)

בסרטון זה, אנו מתארים את הבידוד של תת-אוכלוסייה של תאים דמויי גזע סרטניים משורות תאי קרצינומה קשקשיים בראש ובצוואר באמצעות ממיין תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות או FACS. אוכלוסיית הצד המבודדת של תאים יכולה לשמש לניתוח נוסף במורד הזרם.

פרוטוקול

1. בחירת אוכלוסיית צד (SP) על ידי בדיקת Hoechst Dye Efflux

1. צביעת 50 מיליון תאים בצבע Hoechst 33342
   1. הכינו שני צינורות סטריליים של 15 מ"ל עם תחתית חרוטית: צינור אחד שכותרתו "Hoechst", והשני שכותרתו "Hoechst and Verapamil". הכן 10 מ"ל של 5 mM Verapamil hydrochloride פתרון במים סטריליים. הכינו את מדיום התרבית (CM) לתאי גזע.
      1. כדי להכין CM עבור CSC (CM-CSC), שלבו את הדברים הבאים: מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM): F12 (1:3, v:v), 5% מסרום עגל עובר (FCS), 0.04 מ"ג/ליטר הידרוקורטיזון, 100 U/mL פניצילין, 0.1 גרם/ליטר סטרפטומיצין ו-20 מיקרוגרם/ליטר של גורם גדילה אפידרמלי (EGFR).
   2. תחת מכסה מנוע זרימה למינרית, טריפסינזציה תאים. יש להסיר מדיה, לשטוף במי מלח חוצצים סטריליים של פוספט (PBS) ולהוסיף 1 מ"ל טריפסין-EDTA (0.5 גרם/ליטר) לקבלת בקבוק בגודל 75 סמ"ר. יש לדגור 3 דקות ב-37°C. עצור את התגובה על ידי הוספת מדיום תרבית המשמש לקו תאי ההורים. ספור את מספר התאים באמצעות מונה תאים.
      1. כדי להכין CM לקו תאי ההורים (CM-P), להשלים DMEM עם 10% FCS, 0.4 מ"ג / ליטר של הידרוקורטיזון, 100 U / מ"ל של פניצילין, ו 0.1 גרם / ליטר של סטרפטומיצין).
   3. לדלל את תרחיף התא המתקבל בשלב 1.1.2 כדי לקבל 10⁷ תאים/מ"ל ב-CM-P. לפצל את השעיית התא בשני צינורות מוכנים: לשים 100 μL (10,⁶ תאים) בצינור "Hoechst ו Verapamil" ו 4 מ"ל (4 x 10⁷ תאים) בצינור "Hoechst".
   4. במדגם "Hoechst ו Verapamil", להוסיף 10 μL של 5 mM Verapamil hydrochloride פתרון (ריכוז סופי: 0.5 mM) ומערבבים בעדינות. הוסף 5 μL של 1 גרם / L תמיסת Hoechst (ריכוז סופי: 0.1 גרם / ליטר). במדגם "Hoechst", להוסיף 5 μL של 1 גרם / L תמיסת Hoechst לכל 10⁶ תאים (200 μl בסך הכל). מעתה, יש להגן על הדגימות מפני חשיפה ישירה לאור באמצעות רדיד אלומיניום.
   5. יש לדגור על כל הצינורות באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך שעה ו-30 דקות. יש לערבב בעדינות כל 15 דקות כדי למנוע מהתאים לשקוע.
   6. צינורות צנטריפוגות ב 250 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להסיר supernatant ו resuspend כל גלולה עם 2 מ"ל של 1x PBS.
   7. צינורות צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להסיר supernatant. יש להשהות מחדש את גלולת "Hoechst and Verapamil" ב-500 מיקרוליטר של 5 מ"ג/ליטר פרופידיום יודיד (PI) מדולל במאגר PBS וגלולת "Hoechst" ב-4 מ"ל של 5 מ"ג/ליטר PI מדולל במאגר PBS.
   8. העבר תמיסות דגימה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להסיר אגרגטים ולאסוף תאים בודדים בצינורות לקליטת דגימה בציטומטר הזרימה. יש לשמור דגימות על קרח ולהגן מפני חשיפה ישירה לאור באמצעות רדיד אלומיניום.

2. בידוד אוכלוסיית הצד למעט צבע Hoechst על ידי מיון תאים

1. ביצוע הפרדת תאים שלילית Hoechst על ממיין ציטומטריית זרימה עם הפרמטרים הבאים: לייזר UV (355 ננומטר), שני גלאים בנתיב לייזר UV עם מסנני Hoechst כחול (450/50 BP) ואדום Hoechst (610/20 BP), ושני אספנים.
   1. ראשית, לנתח את הדגימה "Hoechst" המשמש בקרה חיובית עבור צביעה וזרימה cytometer הגדרה.
   2. באמצעות תוכנת הציטומטר, בחלון "גליון עבודה גלובלי", לחץ על "Dot Plot" (התמונה הימנית העליונה החמישית) וצור תרשים בגליון העבודה הגלובלי. על תיאום, בלחיצה ימנית, בחר FSC-A (פיזור קדימה) ועל abscissa, SSC-A (פיזור צד) (איור 1A). באותו אופן, צור תרשים נקודות SSC-W לעומת SCC-H. בתרשים הנקודה השניה הזו, כדי ליצור אזור P1, לחץ על "שער מצולע" (התמונה הימנית העליונה הארבע-עשרה) (איור 1B).
      הערה: אזור P1 יקיף תאים בודדים ויבחין בין תאים כפולים.
   3. אופציונלי: אל תכלול תאים חיוביים של PI על-ידי יצירת FSC-A לעומת PI מגודר ב- P1. בתרשים נקודה זה, בחר את האוכלוסייה השלילית של PI (P2) כדי לא לכלול תאים מתים חיוביים של PI.
   4. באמצעות תוכנת הציטומטר, בחלון "גליון עבודה גלובלי", לחץ על "Dot Plot" וצור תרשים בגליון העבודה הגלובלי. על קאורדינטה, בלחיצה ימנית, בחר כחול Hoechst-A ועל abscissa, אדום Hoechst-A. בלחיצה ימנית על האוכלוסייה, בחר "הצג אוכלוסייה" ו- P1. בתרשים הנקודות הזה, צרו אזור (P2) כדי לבחור את תאי אוכלוסיית הצד השלילית של צבע Hoechst (SP) שמופיעים כזרוע צדדית משמאל לאוכלוסיית התאים העיקרית (איור 1C).
2. לנתח את המדגם "Hoechst" ולאסוף 10,000 אירועים. כדי להבטיח שהשער P2, המייצג את אוכלוסיית ה-SP, ממוקם היטב, נתחו את המדגם "Hoechst and Verapamil" (10,000 אירועים) כדי לצפות בהיעלמות אוכלוסיית ה-SP (איור 1D).
3. אסוף את התאים השליליים בצבע SP Hoechst בצינור של 15 מ"ל המכיל 1 מ"ל של CM-CSC שהוכן בשלב 1.1.1.
4. בסוף מיון התא, צנטריפוגה את תרחיף התא ב 250 x גרם במשך 5 דקות, להסיר את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה עם 1 מ"ל של CM-CSC. ספור את מספר התאים הממוינים באמצעות מונה תאים והעבר מספר מתאים של תאים לבקבוק תרבית (ראה טבלה 1). מוסיפים CM-CSC ודגורים על אטמוספירה של 37°C ו-5% CO₂.
5. לשמור על תאים בתרבית באותם תנאים לכל היותר שני מעברים עד שיש מינימום של 5 x 10⁷ תאים.

טבלה 1: סוג בקבוק התרבית לשימוש לפי מספר התאים הממוינים. ניתנים פרטים על גודל בקבוק התרבית עבור מספר משוער של תאים ממוינים. נפח טריפסין ונפח המדיום הדרוש לסוג בקבוק התרבית מסופקים גם כן.

מספר התאים הממוינים	סוג בקבוק תרבות	נפח טריפסין (מ"ל)	תרבות נפח בינוני (מ"ל)
10,000-200,000	1 באר של צלחת 6 בארות או צלחת פטרי 3.5 ס"מ	0.5	2
200,000-1,000,000	1 בקבוק תרבית T25	1	4
>1,000,000	1 בקבוק תרבית T75	2	10

תוצאות

תרשים 1: בידוד אוכלוסיית צד למעט צבע Hoechst.(A) FSC-A לעומת SSC-A dot plot. (B) תרשים נקודות SSC-W לעומת SSC-H. (ג, ד) Hoechst Red-A לעומת Hoechst Blue-A dot plot באמצעות צינור "Hoechst" (C) או עם הצינור "Hoechst and Verapamil" (D).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סרום עגל עוברי זהב	GE שירותי בריאות	א15-151
הידרוקורטיזון מסיס במים	סיגמא-אולדריץ'	H0396-100 מ"ג
פניצילין/סטרפטומיצין 100x	דומיניק דוטשר	L0022-100
DMEM	גיבקו	61965-026
תערובת אגוזים F12 (1x) + GlutaMAX-I	גיבקו	31765-027
EGF	פרומגה	G5021	הפתרון חייב להיות מוכן ממש לפני השימוש כי זה מאוד יציבה
הפארין	טכנולוגיות StemcellTM	7980
תוסף B-27 (פי 50), מינוס<בר/> ויטמין A	גיבקו	12587-010
פניצילין/סטרפטומיצין 100x	דומיניק דוטשר	L0022-100
DMEM	גיבקו	61965-026
תוסף B-27 (פי 50), מינוס<בר/> ויטמין A	גיבקו	12587-010
הוכסט 33342	סיגמא-אולדריץ'	14533	רעילות קורוזיבית, חריפה (דרך הפה, עור, שאיפה) קטגוריה 4
וראפאמיל הידרוכלוריד	סיגמא-אולדריץ'	V-4629	רעילות חריפה (דרך הפה, העור, שאיפה) קטגוריה 3
פרופידיום יודיד	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 4170	רעילות חריפה (דרך הפה, העור, שאיפה) קטגוריה 4
קו תאי SQ20B	מתנה מ- John Little's מעבדה	-
קו תאי FaDu	ATCC	HTB-43
תוכנת BD FACSDiva v8.0.1	BD Biosciences	-