Cancer Side Population Discrimination Assay: שיטה לבידוד תאים סרטניים דמויי גזע באמצעות Hoechst Dye Efflux Assay

תקציר

מקור: Gilormini, M. et al. בידוד ואפיון תת-אוכלוסיית תאי קשקש בראש ובצוואר בעלת מאפיינים של תאי גזע. J. Vis. Exp. (2016)

בסרטון זה, אנו מתארים את הבידוד של תת-אוכלוסייה של תאים דמויי גזע סרטניים משורות תאי קרצינומה קשקשיים בראש ובצוואר באמצעות ממיין תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות או FACS. אוכלוסיית הצד המבודדת של תאים יכולה לשמש לניתוח נוסף במורד הזרם.

פרוטוקול

1. בחירת אוכלוסיית צד (SP) על ידי בדיקת Hoechst Dye Efflux

1. צביעת 50 מיליון תאים בצבע Hoechst 33342
   1. הכינו שני צינורות סטריליים של 15 מ"ל עם תחתית חרוטית: צינור אחד שכותרתו "Hoechst", והשני שכותרתו "Hoechst and Verapamil". הכן 10 מ"ל של 5 mM Verapamil hydrochloride פתרון במים סטריליים. הכינו את מדיום התרבית (CM) לתאי גזע.
      1. כדי להכין CM עבור CSC (CM-CSC), שלבו את הדברים הבאים: מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM): F12 (1:3, v:v), 5% מסרום עגל עובר (FCS), 0.04 מ"ג/ליטר הידרוקורטיזון, 100 U/mL פניצילין, 0.1 גרם/ליטר סטרפטומיצין ו-20 מיקרוגרם/ליטר של גורם גדילה אפידרמלי (EGFR).
   2. תחת מכסה מנוע זרימה....

תוצאות

תרשים 1: בידוד אוכלוסיית צד למעט צבע Hoechst.(A) FSC-A לעומת SSC-A dot plot. (B) תרשים נקודות SSC-W לעומת SSC-H. (ג, ד) Hoechst Red-A לעומת Hoechst Blue-A dot plot באמצעות צינור "Hoechst" (C) או עם הצינור "Hoechst and Verapamil" (D).

....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סרום עגל עוברי זהב	GE שירותי בריאות	א15-151
הידרוקורטיזון מסיס במים	סיגמא-אולדריץ'	H0396-100 מ"ג
פניצילין/סטרפטומיצין 100x	דומיניק דוטשר	L0022-100
DMEM	גיבקו	61965-026
תערובת אגוזים F12 (1x) + GlutaMAX-I	גיבקו	31765-027
EGF	פרומגה	G5021	הפתרון חייב להיות מוכן ממש לפני השימוש כי זה מאוד יציבה
הפארין	טכנולוגיות StemcellTM	7980
תוסף B-27 (פי 50), מינוס<בר/> ויטמין A	גיבקו	12587-010
פניצילין/סטרפטומיצין 100x	דומיניק דוטשר	L0022-100
DMEM	גיבקו	61965-026
תוסף B-27 (פי 50), מינוס<בר/> ויטמין A	גיבקו	12587-010
הוכסט 33342	סיגמא-אולדריץ'	14533	רעילות קורוזיבית, חריפה (דרך הפה, עור, שאיפה) קטגוריה 4
וראפאמיל הידרוכלוריד	סיגמא-אולדריץ'	V-4629	רעילות חריפה (דרך הפה, העור, שאיפה) קטגוריה 3
פרופידיום יודיד	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 4170	רעילות חריפה (דרך הפה, העור, שאיפה) קטגוריה 4
קו תאי SQ20B	מתנה מ- John Little's מעבדה	-
קו תאי FaDu	ATCC	HTB-43
תוכנת BD FACSDiva v8.0.1	BD Biosciences	-