1. בדיקת MTT לתאים לוקמיים
- הכינו מראש את תמיסת MTT: יש להמיס 500 מ"ג פורמזן MTT ב-10 מ"ל PBS ולערבב (מוגן מפני אור) עם מערבל מגנטי למשך כשעה. לעקר את התמיסה עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
הערה: ניתן לאחסן את התמיסה ב 10 מ"ל aliquots ב -20 ° C. יש להגן מפני אור ישיר לאחר ההפשרה.
- הכינו מראש את האיזופרופנול החומצי: הוסיפו 50 מ"ל של 2 M HCl ל-2.5 ליטר של isopropanol.
הערה: יש לאחסן את התמיסה למשך חודש לפחות בטמפרטורת החדר לפני השימוש. אם האיזופרופנול אינו חומצי כראוי, הוא עלול ליצור משקעים עם התווך ולפגוע בקריאה הספקטרופוטומטרית.
- הכינו לוח "יום 0" (בקרה) תחתון שטוח נפרד של 96 בארות כדי להבטיח הערכה מדויקת יותר של עיכוב גדילה: הקדישו 3 עד 6 בארות לכל קו תא, הוסיפו 30 מיקרוליטר של מדיום גידול ו-120 מיקרוליטר של תרחיף תאים (8,000 תאים) לכל באר ו-150 מיקרוליטר של מדיום גידול לבארות המתאימות לחסר (ללא תאים). המשך משלב 1.9 לשלב 1.13 של סעיף זה כדי למדוד את הצפיפות האופטית (OD).
- הכינו צלחת ניסוי בעלת 96 בארות בעלות תחתית שטוחה: הקדישו 30 בארות לריכוזי תרופות (10 ריכוזים, כל אחד במשולש), 10 בארות לבקרת תאים ו-10 בארות לשליטה בתווך ללא תאים (ריקים) והכינו טווח דילול תרופות של דקסמתזון (Dex) תוך שימוש בדימתיל סולפוקסיד כממס.
הערה: עבור תאי CEM-WT, טווח דילול Dex הוא בין 2 מיקרומטר ל- 0.97 ננומטר. עבור תאי CEM/R30dm, CEM-R5 ו-CEM-C3, טווח דילול Dex הוא בין 640 מיקרומטר ל-0.33 ננומטר.
- הוסף 30 μL מכל דילול Dex לבאר מתאימה של צלחת 96 בארות. הקפידו לכלול כל ריכוז במשולש.
- הוסף 30 μL של מדיום גידול לבארות המתאימות לתאי ביקורת ו- 150 μL של מדיום גידול לבארות המתאימות לחסר.
- קצור תאים הגדלים באופן אקספוננציאלי והשהה מחדש בריכוז הזריעה האופטימלי שלהם.
הערה: על מנת לקבוע ריכוזי תאים התחלתיים אופטימליים, מומלץ להעריך את פרופיל הגדילה של כל קו תאים בצלחת של 96 בארות על ידי זריעת תאים במספר ריכוזים ומדידתו מדי יום במשך 4 ימים לפחות. בחר ריכוז זריעה המונע צמיחת יתר של תאים לאחר 72 שעות, שכן זה ישפיע על הניסוי על ידי רוויה של ערכי OD. עבור CEM-WT, CEM-C5 ו- CEM-R5, ריכוז הזריעה האופטימלי הוא 8,000 תאים / באר, ואילו עבור CEM/R30dm, הוא 5,000 תאים / באר.
- הוסף 120 μL של תרחיף התא לכל באר המכילה את תמיסת התרופה או את מדיום הגידול (בארות המתאימות לתאי ביקורת). מלא את הבארות החיצוניות הריקות של הצלחת עם PBS 150 μL כדי להבטיח לחות טובה בצלחת ודגר על הצלחות במשך 72 שעות ב 37 ° C עם 5% CO₂ באינקובטור תרבית תאים.
- הוסיפו 15 מיקרוליטר של תמיסת MTT לכל באר ונערו את הצלחת במשך 5 דקות עם שייקר צלחת עד למקסימום של 900 שייקים לדקה.
- מחזירים את הצלחות לטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ באינקובטור של תרבית תאים ודגרים במשך 4-6 שעות נוספות.
- מוסיפים 150 μL של איזופרופנול חומצי לכל באר ומערבבים היטב עם פיפטה רב ערוצית כדי להשהות מחדש ביסודיות את כל גבישי הפורמזן. התחילו עם הבארות הריקות והקפידו לשטוף היטב את הקצוות לפני שממשיכים לשורה נוספת של הצלחת.
- דוגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות.
- באמצעות קורא מיקרו-לוחות, קבע את OD ב- 540 ו- 720 ננומטר כדי להבטיח מדידה מדויקת על-ידי תיקון OD ברקע. לאחר מכן, שמור נתונים בקובץ גיליון אלקטרוני ונתח אותם.
2. ניתוח נתונים עבור בדיקת MTT
- חשב את ערכי OD של תאים ב- "Day 0" באמצעות הנוסחה הבאה:
OD Day 0 =תאי בקרה OD -בארות OD ריקות ממוצעות
- חשב את אחוז התאים ששרדו עבור כל ריכוז תרופה לפי הנוסחה הבאה:
% תאים מטופלים = ממוצע [תאים שטופלו ב- OD - בארותריקות OD ממוצעות -יום OD 0]/[תאי בקרה OD -בארות ריקות OD ממוצעות -OD Day0]*100
- התווה את עקומת המינון-תגובה (ריכוז התרופה לעומת עיכוב גדילה ב%).
- חשב את ריכוז התרופה המעכבת את צמיחת התאים ב -50% (IC50) באמצעות עקומת המינון-תגובה.
