בדיקת מוות תאי באמצעות צביעת DAPI: שיטה לסינון מהיר של מוות תאי קלונוגני המושרה על ידי IR בקווי תאים סרטניים

Abstract

מקור: Kobayashi, D. et al. פרוטוקול שלב אחד להערכת מצב מוות תאי קלונוגני המושרה על ידי קרינה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את המתודולוגיה לסינון פרופילי מוות תאי עיקריים בקווי תאים סרטניים המושרים על ידי קרינה מייננת (IR) באמצעות בדיקת צביעה DAPI. גרעיני DAPI המוכתמים ב-DAPI של תאי מטרה העוברים מוות תאי מציגים מורפולוגיות שונות וניתן לזהותם בקלות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Protocol

1. הכנת חומרים

1. כיסויי אוטוקלאבה
   1. הניחו את הכיסויים בתוך זכוכית.
   2. מכסים את הזכוכית בנייר כסף.
   3. Autoclave ב 121 ° C ב 15 psi במשך 20 דקות.
   4. יש לייבש ב-50°C. יש לאחסן בטמפרטורת החדר במכסה תרבית.
2. הכינו את תמיסת הקיבוע: 3% פרפורמלדהיד + 2% סוכרוז במי מלח חוצצי פוספט (PBS)
   1. לבקבוק זכוכית של 1,000 מ"ל, יש להוסיף 700 מ"ל PBS ו-30 גרם paraformaldehyde.
      זהירות: Paraformaldehyde הוא קורוזיבי, ללבוש כפפות מתאימות.
   2. ממיסים פרפורמלדהיד לחלוטין על ידי חימום ל-80°C באמצעות מיקרוגל.
      זהירות: אדי פרפורמלדהיד רעילים, יש לעטות....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
תלוש כיסוי	מאטסונאמי	C013001
פרפורמאלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	P6148-1KG
סוכרוז	סיגמא-אולדריץ'	84097-250ז
מלח חוצץ פוספט	קוסמו ביו	16232000
אזמל	קאי מדיקל	מס' 20, 520-א
צלחת תרבית תאים 35 מ"מ	בז	353001
מיקרוסקופ פאזה הפוכה	שימאזו	114-909
מקרין רנטגן	פסיטרון ביופטיקס	פקסיטרון RX-650
מנת תרבות מרובעת	קורנינג	431110
זכוכית שקופיות	מאטסונאמי	בעד 11
מגיב צביעת DAPI	איתות סלולרי	8961S
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	ניקון	ליקוי חמה ני
מיקרוסקופ פלואורסצנטי מסנן DAPI	ניקון	U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410
עדשות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (20×)	ניקון	תוכנית Apo λ 20X/0.75
עדשת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (60×, שמן)	ניקון	תוכנית אפו λ 60X/1.40 שמן
נפט	אולימפוס	N5218600
מצלמת CCD	ניקון	DS-Qi2
תוכנה לרכישת תמונות דיגיטליות	ניקון	מסמך NIS-Elements
מנקה עדשות	אולימפוס	OT0552
כלורופורם	וואקו	035-02616