בדיקת מוות תאי באמצעות צביעת DAPI: שיטה לסינון מהיר של מוות תאי קלונוגני המושרה על ידי IR בקווי תאים סרטניים

תקציר

מקור: Kobayashi, D. et al. פרוטוקול שלב אחד להערכת מצב מוות תאי קלונוגני המושרה על ידי קרינה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את המתודולוגיה לסינון פרופילי מוות תאי עיקריים בקווי תאים סרטניים המושרים על ידי קרינה מייננת (IR) באמצעות בדיקת צביעה DAPI. גרעיני DAPI המוכתמים ב-DAPI של תאי מטרה העוברים מוות תאי מציגים מורפולוגיות שונות וניתן לזהותם בקלות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

פרוטוקול

1. הכנת חומרים

1. כיסויי אוטוקלאבה
   1. הניחו את הכיסויים בתוך זכוכית.
   2. מכסים את הזכוכית בנייר כסף.
   3. Autoclave ב 121 ° C ב 15 psi במשך 20 דקות.
   4. יש לייבש ב-50°C. יש לאחסן בטמפרטורת החדר במכסה תרבית.
2. הכינו את תמיסת הקיבוע: 3% פרפורמלדהיד + 2% סוכרוז במי מלח חוצצי פוספט (PBS)
   1. לבקבוק זכוכית של 1,000 מ"ל, יש להוסיף 700 מ"ל PBS ו-30 גרם paraformaldehyde.
      זהירות: Paraformaldehyde הוא קורוזיבי, ללבוש כפפות מתאימות.
   2. ממיסים פרפורמלדהיד לחלוטין על ידי חימום ל-80°C באמצעות מיקרוגל.
      זהירות: אדי פרפורמלדהיד רעילים, יש לעטות מסכה.
   3. יש להשאיר בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
   4. מוסיפים 20 גרם סוכרוז.
   5. הוסף PBS כדי להפוך את הנפח הכולל ל- 1 L.
   6. Aliquot ב 50 מ"ל צינורות. פתרון קיבוע ניתן לאחסן במשך 3 שנים ב -20 ° C או במשך 3 חודשים ב 4 ° C.

2. הקרנה

זהירות: יש לטפל במקרין הרנטגן בזהירות בהתאם להוראות היצרן.

1. בחנו את התאים תחת מיקרוסקופ בפאזה הפוכה. ודא כי התאים מחוברים לכיסוי וחיים.
2. להקרין את המנה עם 6 Gy רנטגן (1.4 Gy / min, 300 KVP, 20 mA).
3. דגירה במשך 72 שעות ב-37°C באטמוספירה המכילה 5% CO₂.
   הערה: ניתן לשנות את זמן הדגירה בהתאם לתכנון הניסוי

3. קיבוע

1. שאפו מדיה תרבותית מהמנה.
2. בעזרת מספריים, חותכים קצה של מיקרופיפטה 1,000 μL 5 מ"מ מהסוף.
   הערה: קצה החיתוך מסייע ליישם בצורה חלקה את פתרון הקיבוע.
3. בעזרת קצה החיתוך, מוסיפים 1 מ"ל פתרון קיבוע (מוכן בשלב 1.2) לצלחת מהדופן של המנה.
   הערה: שלב זה הוא תלוי זמן ולכן יש לבצע אותו מבלי לשנות את קצות המיקרופיפטה בעת טיפול במספר דגימות. יישום תמיסת קיבוע ישירות לתחתית הצלחת עלול לפגוע בתאים.
4. מניחים את המנה בצלחת תרבות מרובעת. נערו בעדינות את צלחת התרבית המרובעת כדי לפזר את תמיסת הקיבוע על הכיסוי באופן שווה.
5. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
6. שאפו פתרון קיבוע מהמנה.
7. מוסיפים 2 מ"ל PBS לצלחת מדופן המנה.
   הערה: יישום PBS ישירות לתחתית הצלחת עלול לפגוע בתאים.
8. שאפו PBS מהמנה.
9. חזור על שלבים 3.7 ו- 3.8 פעמיים.
   הערה: ניתן לאחסן את המנה במשך שבוע אחד ב 4 ° C עם הכיסויים שטוף 2 מ"ל PBS.

4. צביעת DAPI

1. על שקופית זכוכית, יש למרוח 5 μL 1 μg/mL DAPI staining reagent.
   הערה: מגיב הצביעה DAPI יציב במשך 6 חודשים כאשר מאוחסן מוגן מפני אור ב -20 ° C או פחות.
2. בעזרת אזמל, מסירים את הכיסוי מהצלחת.
3. משכו את עודפי PBS על הכיסוי על ידי נגיעה בקצה הכיסוי עם מגבת נייר.
4. הרכיבו את הכיסוי הפוך על טיפת מגיב צביעת DAPI במגלשת הזכוכית, כך שהתאים נחשפים למגיב צביעה DAPI.
   הערה: שלב זה הוא תלוי זמן. ייבוש מגיב הצביעה DAPI עלול להוביל להכתמה תת-אופטימלית.
5. הדגימות ניתן לאחסן במשך שנה אחת ב -20 ° C.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תלוש כיסוי	מאטסונאמי	C013001
פרפורמאלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	P6148-1KG
סוכרוז	סיגמא-אולדריץ'	84097-250ז
מלח חוצץ פוספט	קוסמו ביו	16232000
אזמל	קאי מדיקל	מס' 20, 520-א
צלחת תרבית תאים 35 מ"מ	בז	353001
מיקרוסקופ פאזה הפוכה	שימאזו	114-909
מקרין רנטגן	פסיטרון ביופטיקס	פקסיטרון RX-650
מנת תרבות מרובעת	קורנינג	431110
זכוכית שקופיות	מאטסונאמי	בעד 11
מגיב צביעת DAPI	איתות סלולרי	8961S
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	ניקון	ליקוי חמה ני
מיקרוסקופ פלואורסצנטי מסנן DAPI	ניקון	U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410
עדשות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (20×)	ניקון	תוכנית Apo λ 20X/0.75
עדשת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (60×, שמן)	ניקון	תוכנית אפו λ 60X/1.40 שמן
נפט	אולימפוס	N5218600
מצלמת CCD	ניקון	DS-Qi2
תוכנה לרכישת תמונות דיגיטליות	ניקון	מסמך NIS-Elements
מנקה עדשות	אולימפוס	OT0552
כלורופורם	וואקו	035-02616