כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת פיגום ושט דה-צלולרי
- השג ושט חזירי שלם בבית מטבחיים מחזירי לנדרייס טריים שנשחטו ומשמשים לייצור מזון. ושט בודד אחד יספק פיגומים מספיקים לכ-30 מבנים נפרדים.
הערה: בשל פרוטוקול העיקור הנרחב וגוזל הזמן הנדרש, בדרך כלל כדאי להשיג ולעבד מינימום של 10 ושט בו זמנית.
- הכניסו מיד את הוושט שזה עתה נכרת לסיר סטרילי בנפח 180 מ"ל המכיל כ-150 מ"ל של תמיסת 10% פובידון-יוד למשך 5 דקות כדי להפחית את העומס המיקרוביאלי המזהם. מעבירים את הוושט לסיר שני המכיל כ-100 מ"ל PBS סטרילי המכיל 200 IU/מ"ל פניצילין, 200 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ו-1.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B.
- יש להחליף את מכסה המיכל ולהעביר את הוושט חזרה למעבדה בטמפרטורת החדר. שניים או שלושה ושט ניתן להעביר בכל מכולה, בהתאם לגודלם.
- לאחר ההגעה למעבדה, טפל ברקמה במכסה מנוע זרימה למינרית באמצעות טכניקה אספטית כדי למזער זיהום מיקרוביאלי. יש לעקר פינצטה, מספריים ולהבי אזמל על ידי השריה למשך 5 דקות באתנול 70% ושטיפה ב-PBS סטרילי.
- טפלו בוושט באמצעות פינצטה סטרילית. בעזרת המספריים, לחתוך לפתוח את הוושט לאורך. שטפו את הרקמה על ידי הכנסת הוושט לסיר סטרילי של 180 מ"ל המכיל כ-100 מ"ל PBS סטרילי ורעד עדין כדי להסיר לכלוך.
- נקו קרש דיסקציה של פקק על ידי ריסוס נדיב באתנול 70% והניחו לו להתייבש.
- הסר את הוושט מן PBS, ובאמצעות מחטים סטריליות, לנעוץ את הוושט על הלוח, משטח הרירית העליון ביותר. אחזו את משטח הרירית בקצה אחד של הוושט בפינצטה סטרילית והתרחקו מהלוח. פעולה זו תפריד את הרירית מהתת-רירית הבסיסית.
- לאחר מכן, השתמש בלהב אזמל סטרילי כדי לנתח את הוושט לאורך לאורך lamina propria, הסרת סיכות ככל שהדיסקציה מתקדמת כדי לאפשר את הרירית להיות מורם משם.
- שמור על הרירית המנותחת והשלך את תת הרירית שמתחתיה.
- חותכים ומשליכים את 2 הס"מ הפרוקסימליים והדיסטליים ביותר של הרירית מכיוון שיש מספר גדול יותר של בלוטות תת-ריריות ולמינה פרופריה עבה יותר באזורים אלה, בהתאמה.
- השתמש באזמל כדי לחתוך את הרקמה הנותרת לתוך 5 ס"מ2. מניחים את כל הרקמה החתוכה בסיר סטרילי של 180 מ"ל המכיל כ-150 מ"ל PBS סטרילי ומערבבים בעדינות כדי לשטוף את הרקמה. אם מעבדים יותר מחמישה ושט בבת אחת, ייתכן שיהיה צורך להשתמש במספר סירים עבור זה ואת שלושת השלבים הבאים.
- באמצעות פינצטה סטרילית, מעבירים את הרקמה החתוכה לסיר של 180 מ"ל המכיל 150 מ"ל של 1 מ"ל NaCl סטרילי, 200 IU/מ"ל פניצילין, 200 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, ו-1.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B. לדגור במשך 72 שעות ב-37°C.
- מניחים את הרקמה בסיר טרי של 180 מ"ל המכיל PBS סטרילי של 150 מ"ל. האפיתל יתחיל להיפרד באופן גלוי מהרקמה הבסיסית. מקלפים בעדינות את האפיתל המנתק מוושט החזיר באמצעות מלקחיים סטריליים ומשליכים.
- מניחים את הרקמה הנותרת בסיר טרי של 180 מ"ל ומוסיפים 150 מ"ל PBS סטרילי. יש לשטוף בעדינות במשך 5 דקות. יוצקים את PBS וחוזרים על הפעולה פעמיים נוספות עם PBS טרי.
- הכניסו את כל הרקמה לבקבוק זכוכית של 500 מ"ל המכיל 400 מ"ל של תמיסת גליצרול סטרילית 80% (v/v) למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. מעבירים ל-400 מ"ל של תמיסת גליצרול סטרילית 90% (v/v) למשך 24 שעות נוספות.
- יש לאחסן ב-400 מ"ל של תמיסת גליצרול סטרילית 100% בטמפרטורת החדר למשך 4 חודשים לפחות כדי לייבש ולעקר את הרקמה תוך שמירה על שלמות קרום המרתף.
