מאמר שיטה

מיצוי אקסוזום מגנטי מבוסס חרוזים: טכניקה לבידוד אקסוזומים ספציפיים מנוזלים ביולוגיים

30 באפריל 2023

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Tu, M. et al. Detection of Exosomal Biomarkers by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM). J. Vis. Exp. (2015)

בסרטון זה אנו מדגימים הליך לבידוד אקסוזומים מנוזלי מטרה באמצעות מיקרו-כדוריות מגנטיות. ההליך מאפשר לכידה מהירה של אקסוזומים, אשר יכולים לשמש לניתוח במורד הזרם.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מיצוי אקסוזום מגנטי מבוסס חרוזים

  1. פיפטה, תמיסה מעורבת היטב של 5 μL של מיקרו-חלקיקים מגנטיים מצופים סטרפטווידין לתוך 495 μL של חיץ מלח חוצץ פוספט (PBS) בצינור מיקרוצנטריפוגה כדי להשעות מחדש את החרוזים. שטפו והשעו מחדש את החרוזים עם 500 מיקרוליטר של PBS שלוש פעמים באמצעות מדף מגנטי. המדף הוא מערך של מגנטים בצד יחידת דיור שיכולים להכיל את צינורות המיקרוצנטריפוגות לדוגמה.
    1. עבור כל כביסה, ראשית, הניחו לצינורות לשבת על המדף למשך דקה אחת ולאחר מכן השתמשו בקצה פיפטה כדי להסיר בזהירות את חיץ הסופרנאטנט מבלי להפריע לחרוזים.
    2. הניחו את הצינורות על מדף רגיל ללא מגנטים בצד. הוסף 500 μL של PBS לתוך צינורות ולהשתמש פיפטה כדי לערבב את התמיסה ואת החרוזים יחד. לאחר מכן, החזירו את הצינורות למדף המגנטי כדי להפריד שוב את החרוזים מהתמיסה.
    3. בצע הסרה זו של החיץ באמצעות מגנטיזציה והשעיה ב- PBS בסך הכל שלוש פעמים. פעולה זו מבצעת שטיפה ראשונית של החלקיקים המגנטיים.
  2. השהה מחדש את החרוזים לתוך 490 μL של מאגר PBS, כאשר הצינור ממוקם על החלק הלא ממוגנט של המדף המגנטי. פיפטה 5 μL של נוגדן CD63 נגד עכבר biotinylated בריכוז מלאי 1.0 מ"ג / מ"ל לתוך תערובת של חרוזים. השתמש פיפטה כדי לערבב את החרוזים ואת הנוגדנים בתמיסה.
  3. מניחים את צינורות המיקרוצנטריפוגות עם תערובת חרוזים ונוגדנים ביוטינילציה על מסובב דגימה. הגדר את הפרמטרים המסובבים עבור מסובב הדגימה לסיבוב הדדי ב- 90°, הטיה למשך 5 שניות ורטט ב- 5° למשך שנייה אחת. סובב את צינורות תערובת החרוזים לדוגמה בפרמטרים אלה במשך 30 דקות ב- RT.
  4. יש להסיר נוגדן לא קשור לאחר הצמידה.
    1. לאחר 30 דקות של סיבוב ב-RT, החזירו את הצינורות למדף המגנטי למשך 5 דקות.
    2. בצע שלוש שטיפות של חרוזים על ידי הסרת השלב הנוזלי באמצעות micropipette ולשטוף עם 500 μL של PBS. לאחר השטיפה המשולשת, השהו מחדש את החרוזים ב-490 מיקרוליטר קזאין-PBS והניחו אותם על החלק הלא ממוגנט של המדף.
  5. מיצוי אקסוזום באמצעות חרוזים מצופים נוגדנים.
    1. תייגו כל צינורית עם מזהה הדגימה הממוקד. פיפטה דגימה של 10 μL של סרום או רוק לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. השתמש פיפטה כדי לערבב את הדגימה ואת החרוזים מגנטיים על ידי pipetting מספר פעמים.
    2. מקם את הצינורות עם דגימה וחרוזי נוגדנים CD63 אנטי אנושיים על המסובב וסובב במשך שעתיים ב- RT. השתמש באותם פרמטרים מסובבים כמתואר בשלב 1.3.
    3. לאחר שעתיים של סיבוב דגימה, בצעו שטיפה משולשת על ידי מגנטיזציה להפרדת חרוזים מתמיסה, הסרת פאזה נוזלית עם מיקרופיפטה, והשעיית חרוזים ב-500 מיקרוליטר של חיץ Tris-HCl. החרוזים המתקבלים קשורים כעת לאקסוזומים ומוכנים לשחרור השדה החשמלי ולמדידה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן CD63 אנטי אנושי Biotinylated Ancell, ארצות הברית215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Invitrogen, ארצות הברית65601
Neodynium Magnetics (קוטר 1/10 אינץ' x 1/32 אינץ' עובי) K&J Magnetics, ארצות הבריתDH101
מים מזוקקים טהורים במיוחד Life Technologies, ארה"ב10977-023
Anti-Fluorescein-POD, שברי Fab Roche, גרמניה11426346910
תמיסת מלח חוצצת פוספט Life Technologies, ארה"ב10010023
קזאין/PBS Fisher Scientific, ארצות הברית37532

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CD63

מאמרים קשורים