$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. עיכול רקמות
- באמצעות צלחת תרבית רקמה בקוטר 100 מ"מ, טחנו באופן מכני את הרקמה לחתיכות עדינות בגודל ~1-2 מ"מ באמצעות מספריים ומלקחיים כירורגיים מעוקרים אוטוקלאביים (איור 1B, C). יש לחתוך את רקמת החיבור בין החלקים כדי להבטיח הפרדה נכונה וקלות בשלבים נוספים.
- הוסף 6 מ"ל של תמיסת dispase/collagenase לרקמה הטחונה. לאחר מכן יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך כ-30 דקות עד שעה אחת.
- לשבש את הרקמה על ידי pipetting עם פיפטה סרולוגית 5 מ"ל 15-20 פעמים.
- יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות עד שעה נוספות.
- חזרו על שלבים 1.3 ו-1.4 פעמיים-שלוש נוספות או עד שהרקמה דומה לתרחיף ויכולה לעבור בקלות דרך פתח פיפטה (איור 1D).
הערה: הגודל ההתחלתי של דגימת הרקמה ומידת העדינות של טחינת הרקמה יקבעו כמה פעמים צריך לחזור על שלבים 1.3 ו-1.4. בדרך כלל, אנו מקבלים רקמה בגודל של כ 1 ס"מ x 1 ס"מ. בנוסף, ניתן לעקוב אחר דיסוציאציה של רקמות באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי של תרבית רקמה הפוכה כדי לעקוב אחר התקדמות הדיסוציאציה התאית מהרקמה. אשכולות קטנים של תאים הם אידיאליים עבור הצמיחה הראשונית של תאי רוק כמו salispheres.
2. ציפוי בארות במטריצת קרום מרתף
הערה: יש להפשיר מטריצת קרום מרתף (BMM) למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C יום לפני השימוש בה. לאחר ההפשרה, BMM צריך להישמר כל הזמן על קרח או בטמפרטורה של 4°C, שכן הוא יתמצק במהירות (כלומר, ייצור ג'ל) בטמפרטורות חמות יותר. בנוסף, יש להיזהר אם הדגימות צוננו על קרח לפני ציפוי על BMM מכיוון שדגימות קרות "ימיסו" את ה- BMM ויחשפו תאים לצלחת הפלסטיק.
- לאט פיפטה BMM (ראה טבלה של חומרים) לתוך כל באר כדי להיות מצופה. באופן שווה ולאט לפזר את BMM על הבאר.
הערה: באופן כללי, אנו משתמשים ב- 500 μL לכל באר של צלחת 6 בארות, אך ניתן להתאים נפח זה לשימוש בגרסאות אחרות של צלחות, כגון 12 בארות או 24 בארות, או לפי הצורך עבור הידרוג'לים עבים או דקים יותר.
- יש לדגור על הלוחות המצופים בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות לפחות לפני השימוש כדי לאפשר לזמן ה-BMM להתמצק.
3. סינון רקמות לא מעוכלות, ליזה RBC וציפוי תאים
- העברת רקמות הומוגניות משלב 1.5 לצינור חרוטי 15 מ"ל. יש לשטוף פעם אחת את הצלחת עם 6 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (DPBS) של Dulbecco כדי להעביר את התאים הנותרים.
- סנן את ההומוגנט לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל דרך מסננת תא רשת ניילון 70 מיקרומטר כדי להסיר רקמה מעוכלת. צנטריפוגה מתח תאים במשך 5 דקות ב 500 x גרם.
- לדלל 10x RBC lysis חיץ ב dHסטרילי 2O כדי ליצור פתרון עבודה 1x.
- שאפו את הסופר-נאנט. לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת התא ב 10 מ"ל של 1x RBC lysis buffer. יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37°C.
- הוסף 20-25 מ"ל של DPBS כדי לנטרל את מאגר הליזה RBC ולמזער את הליזה של תאי הרוק. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 500 x g.
הערה: לאחר הטיפול עם חיץ ליזה RBC, גלולת התא צריכה להיות לבנה. הצבע האדום בגלולה מצביע על כך שלא כל RBC עברו ליזה מלאה. חזור על שלבים 3.4 עד 3.5 במידת הצורך לקבלת ליזה מלאה של כל RBC.
- שאפו את הסופר-נאנט. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-1-2 מ"ל של BEGM לכל באר, ולאחר מכן להניח תאים מרחפים על בארות מצופות BMM. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C.
- לאחר ציפוי BMM, תאים ייווצרו למבנים כדוריים או "סליספרות" במשך תקופה של 2-3 ימים. תאים יכולים להישמר כסליספרות במשך כ-5-7 ימים לפני שה-BMM מתחיל להתפרק, מה שמאפשר לתאים לגשת לפלסטיק ולהיצמד אליו ולגדול כחד-שכבתי.