$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת בדיקות ננו-חלקיקים
הערה: בדיקה זו משתמשת בננו-מוטות זהב פונקציונליים (AuNRs; קוטר 25 ננומטר x אורך 71 ננומטר) המצומדים באופן קוולנטי עם פולימרים נויטרווידין (AV) ויש להם שיא תהודה פלסמוני פני השטח המפיק אות פיזור אדום (שיא של 641 ננומטר) עם תאורת DFM.
- יש לשטוף 40 μL של AuNR-AV (2.56 x 1011 חלקיקים) שלוש פעמים עם 200 μL PBS (pH 7.0) באמצעות צנטריפוגה ושאיפה (8,500 x גרם ב-4°C למשך 10 דקות), ולאחר מכן שלב אחרון של צנטריפוגה ושאיפה שלאחריו גלולת AuNR-AV תלויה ב-40 μL PBS.
- ערבב תרחיף AuNR-AV זה עם נוגדן 10 μL biotinylated (0.5 מ"ג / מ"ל) ספציפי עבור אנטיגן על פני השטח של תת-סוג exosome של עניין ו 150 μL של PBS ולאחר מכן לערבב ב 4 ° C במשך 2 שעות באמצעות מיקסר כדי לאפשר קישור נויטרווידין-ביוטין להגיע להשלמה.
- שטפו את ה-AuNRs המצומדים בנוגדנים (AuNR-IgG) שלוש פעמים באמצעות צנטריפוגה ושאיפה (6,500 x גרם ב-4°C למשך 10 דקות) ולאחר מכן השהו אותם ב-PBS של 200 μL ואחסנו אותם בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
הערה: יש להשתמש בטכניקה סטרילית ובזמני אחסון קצרים כדי למנוע זיהום והשפלה של AuNR-IgG. עדיף להשתמש ב- AuNRs מצומדים לנוגדנים תוך 24 שעות מהצמידות שלהם.
2. הכנת שקופיות לכידת EV
- יש לדלל נוגדנים נבחרים ללכידת אקסוזום ל-0.025 מ"ג/מ"ל ב-PBS ולהוסיף 1 μL/well של דילול זה לשקופית חלבון A/G מרובת בארות ולאחר מכן לדגור על שקופית זו ב-37°C למשך שעה אחת בתא לח כדי לאפשר קשירת נוגדנים ללכידה לחלבון A/G המשותק בשקופית.
- לשאוף בארות כדי להסיר נוגדנים לא קשורים ולשטוף אותם שלוש פעמים על ידי תוספת ושאיפה של 1 μL / באר של PBS. לאחר מכן, טען כל באר עם 1 μL של חיץ חוסם (ראה טבלה של חומרים) ודגר על השקופית במשך 2 שעות ב 37 ° C בתא לח כדי לחסום את כל אתרי קשירת החלבון שנותרו.
- לשאוף בארות כדי להסיר חיץ חוסם, לשטוף בארות שלוש פעמים על ידי תוספת ושאיפה של 1 μL / באר של PBS, ומיד להשתמש שקופיות חסומות ללכידה exosome וניתוח.
3. הכנת עקומה סטנדרטית
- כדי לכמת במדויק את השפע המוחלט או היחסי של תת-סוג אקסוזום מסוים, על המשתמש ליצור עקומה סטנדרטית עם אוכלוסיית אקסוזום טהורה המבטאת באופן אחיד את הסמן הביולוגי של פני השטח האקזוזומים. מחקר זה מנתח את שפע האקסוזומים המבטאים חלבון קרום הקשור לגרורות, קולטן אפרין A2, שיש לו קשר מדווח לשלב סרטן הלבלב ולפרוגנוזה.
הערה: קו תאי סרטן הלבלב האנושי PANC-1 והאקסוזומים שלו ידועים כמבטאים חלבון זה, ואקסוזומים מבודדים מקו תאים זה שימשו ליצירת עקומה סטנדרטית לכימות מספר האקסוזומים המבטאים חלבון זה בדגימות אקסוזומים מורכבות.
- תרבית תאים במשך 48 שעות בטמפרטורה של 37°C בתרבית ללא נסיוב כדי לאפשר הצטברות אקסוזום במדיה, ולאחר מכן לבודד סופרנאטנטים של תרביות תאים על ידי צנטריפוגה של תרביות תרחיף או שאיפה ישירה של מדיה תרבית מתרביות תאים דבקים.
- צנטריפוגה את המדיה שנאספה ב 2000 x גרם במשך 30 דקות כדי להסיר פסולת לשחזר את supernatant.
- סנן את הסופרנאטנט של התרבית המזוקקת באמצעות יחידת מסנן קשירת חלבון נמוכה של 0.45 מיקרומטר בעלת קיבולת מתאימה (לדוגמה, יחידת סינון ואקום סולפון פוליאתר בנפח 250 מ"ל
).
- רכז את התסנין המתקבל על ידי צנטריפוגה ב 3200 x g באמצעות מערכת סינון מגבלת משקל מולקולרית נומינלית של 100,000 לנפח סופי של 250 μL. אסוף את הנפח שנשמר ממסנן זה, ולאחר מכן שטוף את המסנן עם PBS של 200 μL, ושלב נפח כביסה זה עם נפח הדגימה האקזוזום שנאסף.
- צנטריפוגה דגימה זו ב 21,000 x גרם במשך 45 דקות בזהירות לשחזר את supernatant, נזהר לא לאסוף שום חומר מואץ.
- צנטריפוגה את supernatant התאושש ב 100,000 x גרם במשך 3 שעות כדי לזרז את exosomes. שאפו את הסופרנאטנט ואספו את הגלולה האקזוזום ב-100 מיקרוליטר PBS.
- אחסן את המתלים האקזוזום המתקבלים ב- 4 ° C אם נעשה בהם שימוש תוך 24 שעות או ב- -80 ° C לאחסון לטווח ארוך.
הערה: אין להכפיף דגימות אקסוזום למחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים.
- כימות אליציטוט של תרחיף האקזוזום לאחר ערבוב על ידי מדידה ישירה של מספרים אקסוזומיים (למשל, על ידי ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים או חישת פולס התנגדותי הניתנת לכוונון או על ידי מדידת ריכוז החלבון של ליזטים אקסוזומיים על ידי בדיקת חומצה מיקרו-ביקינכונית, או שיטה מקבילה, כאמצעי לקירוב כמות אקסוזום).
- צור סדרה של דילולים סדרתיים של התרחיף האקזוזום כדי לאפשר השוואה של אות ננו-חלקיקי לקלט מספר אקסוזום או תכולת חלבון.
- העבר 1 μL מכל תקן אקסוזום לכל אחת מהבארות המשוכפלות שלו על צלחת הבדיקה.
הערה: ניתן להשתמש בעקומות סטנדרטיות כדי לחשב את שיפוע קו המתאם בין אות ננו-חלקיקים לריכוז אקסוזום כדי (1) להעריך את ביצועי הבדיקה ו-(2) לקבוע את הריכוז היחסי של אקסוזומי מטרה בדגימות ניסוי.
4. עיבוד דגימות פלזמה או סרום אנושיות
- יש לאסוף דגימות פלזמה או סרום בשיטות סטנדרטיות ולאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לצורך לצורך ניתוח אקסוזום. הפשירו במהירות דגימות באמבט מים בטמפרטורת החדר. ערבבו שוב ושוב את הדגימות המופשרות בהיפוך כדי לקדם השעיה הומוגנית.
הערה: תוצאות מדגימות בסרום ובפלזמה עשויות שלא להיות שקולות מכיוון שיש שחרור משמעותי של אקסוזומים במהלך תגובת הקרישה.
- דגימות פלזמה או סרום צנטריפוגות ב 500 x גרם במשך 15 דקות כדי לזרז צברי חלבונים ופסולת אחרת. העבר aliquot של דגימת פלזמה או סרום לצינור טרי ולהוסיף PBS כדי ליצור דילול 1: 1. ערבבו את הדגימה המדוללת על ידי מערבולות עדינות או היפוך, לפי הצורך. העבר 1 μL של כל פלזמה או תרחיף בסרום לכל אחת הבארות המשוכפלות שלה על צלחת הבדיקה.
5. לכידה וזיהוי אקסוזום
- טען בארות של שקופית לכידת EV חסומה עם 1 μL / באר של דגימה אקסוזומית, באמצעות 8 עותקים משוכפלים לדגימה, ודגר על המגלשה במשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס בתא לח. שאפו את כל בארות הדגימה ולאחר מכן הוסיפו 1 μL/באר של PBS כדי לשטוף בארות ולהסיר אקסוזומים לא קשורים ומזהמים אחרים מהדגימה האקזוזום הטעונה.
- טען בארות מדגם עם 1 μL / באר של מתלה AuNR-IgG שהוכן בעבר (ראה סעיף 1 לעיל) ודגר על המגלשה במשך 2 שעות ב 37 ° C בתא לחות. שאפו את תמיסת הננו-חלקיקים ושטפו את השקופית ב-PBS בתוספת 0.01% Tween-20 (PBST) למשך 10 דקות באמצעות מיקסר, ולאחר מכן שאפו ושטפו את כל בארות הדגימה במים נטולי יונים, למשך 10 דקות באמצעות מיקסר מסתובב וייבשו באוויר לתמונות LMDFM הבאות.
הערה: מקדמי שונות בין בדיקות (CVs) מוערכים משמונה עותקים משוכפלים של אותו מדגם. דוגמאות המציגות קורות חיים >20% נחשבות לא אינפורמטיביות ויש לחזור עליהן, אם יש מדגם מספיק.