חילוץ כליה שלמה מעכבר: טכניקה להשגת כליה ללא כמוסת כליות מדגמי מורין

תקציר

מקור: Grainger, N. et al. בידוד והדמיה חיים ושלמים אזורי קוצב לב של אגן הכליה של עכבר על ידי חתך ויברטום. J. Vis. Exp. (2021)

בסרטון זה, אנו מתארים את הליך מיצוי הכליה מהחלל הרטרופריטוניאלי של העכבר. ניתן לנתח את הכליה המופקת במיקרודיסקציה נוספת כדי לקבל כליה שלמה ללא כמוסת הכליה ושכבת השומן שמסביב.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. דיסקציה של הכליה

1. מרדימים עכברים על ידי שאיפה של 3-4% איזופלורן במכסה מנוע מאוורר. יש לאשר את השראת ההרדמה העמוקה על ידי אובדן רפלקס צביטת הבוהן ו/או הזנב ולאחר מכן להרדים את העכברים על ידי נקע צוואר הרחם.
2. יש למרוח 70% אתנול על החזה כדי להרטיב את הפרווה. בעזרת מספריים לדיסקציה חיצונית, פותחים את חלל הבטן דרך חתך אורכי, עם להבי מספריים בזווית הרחק מהחיה כדי למנוע נזק לאיברים הפנימיים.
3. בעזרת מלקחיים פנימיים ומספריים לדיסקציה פנימית, צובטים את המעיים ומרימים אותם הרחק מדופן הבטן. תוך כדי הרמת המעיים, חתכו את החלק התחתון של המעיים חופשי מהגוף בתריסריון הפרוקסימלי ובמעי הגס הדיסטלי כדי לקבל גישה לחלל הרטרופריטוניאלי המכיל את הכליות.
4. ברגע שהכליות נחשפות, לחלץ אותן בנפרד. צבטו בעדינות והרימו את הקצה הדיסטלי של השופכן (~ 4 מ"מ מהכליה) בעזרת מלקחיים רקמתיים. בעזרת מספריים דיסקציה, לחתוך מתחת את השופכן הצבוט לכיוון הכליה. ממשיכים לחתוך מתחת לכליה עד שהיא משתחררת מרקמת החיבור שמסביב.
   הערה: כדי למקסם את שלמות הרקמה ואת עקביות חיתוך במהלך חתך ויברטום, הכליה חייבת להיות שלמה ככל האפשר. כדי להבטיח זאת, הימנע צביטה או חיתוך של הכליה עם מלקחיים מספריים דיסקציה.
5. מניחים את הכליה עם השופכן המחובר בתמיסת KRB קרה כקרח. חזור על שלבי המיצוי עם הכליה הנגדית כדי להסיר מגוף העכבר. שמור על הכליות בתמיסת KRB על ice.
   הערה: עבור מיד לחלק הבא של הפרוטוקול כדי לשמר את הכדאיות של רקמת PKJ. בגלל מיקומו האנטומי עמוק בפרנכימת הכליות, נמנע מה- PKJ מגע עם תמיסת KRB.

2. להכין את הכליה ללא כמוסת הכליה עבור חתך ויברטומי

1. מעבירים את הכליה לצלחת דיסקציה מצופה אלסטומר סיליקון (60 מ"מ x 15 מ"מ), וממלאים אותה בתמיסת KRB קרה כקרח עד שהכליה שקועה לחלוטין.
2. תחת מיקרוסקופ מנתח, מעגנים את הכליה לבסיס הצלחת על ידי החדרת סיכות זעירות לתוך השופכן הפרוקסימלי ודרך קפסולת הכליה הקדמית הדקה או רקמת השומן שמסביב.
   הערה: היזהר לא לנקב את רקמת parenchyma הכליה.
3. השתמש במספריים קפיציים עדינים ומלקחיים פנימיים כדי להסיר את רקמת השומן מבסיס הכליה כדי לחשוף את RP הדיסטלי ואת השופכן הפרוקסימלי.
4. הסר את השופכן הפרוקסימלי וחלק מה- RP הדיסטלי מבסיס RP באמצעות מספריים קפיציים עדינים.
   הערה: היזהר לא לחתוך את parenchyma הכליה שמסביב. הקו המקווקו השחור באיור 1A מציין את המיקום המשוער של חיתוך זה. חתך זה יוצר בסיס שטוח על הכליה לחיתוך רקמות אחיד יותר. כאשר מנתחים את הכליה, יש להיות מודעים למיקום האנטומי של אזור PKJ. איור 1B מראה שאפשר לחתוך את הכליה השלמה לאורך מישור הקשת כדי לחשוף את המדולה, הפפילה (מדולה דיסטלית שבה צינורות האיסוף נפגשים), ו-RP פרוקסימלי ודיסטלי. אם הפפילה הייתה נחשפת לחלוטין, כמו באיור 1C, ניתן היה לדמיין את ה-PKJ ואת RP הפרוקסימלי (prox RP). עם זאת, זה לא צריך להיעשות עבור טכניקת ויברטום; תיאור זה נועד לכוון את הקורא למיקום PKJ באופן כללי, המודגש בהבדל האנטומי המוצג בתמונות האור המשודרות של אזור PKJ ואזור אמצע RP באיור 1D, E.
5. ניקבו את קפסולת הכליה החיצונית בעזרת מלקחיים עדינים, והרחיקו את הקצוות מגוף הכליה. בעזרת מלקחיים בכל יד, צובטים את הקצוות הרופפים של הקפסולה ומקלפים אותם לגזרים. המשך לקלף בחזרה את קרום כמוסת הכליה הנותרת עד להסרתה לחלוטין.
   הערה: קפסולת הכליה היא שכבה קשה וסיבית המקיפה את הכליה. יש להסירו, לפני חיתוך הוויברטום, לחיתוך אופטימלי.

תוצאות

איור 1: אנטומיה בסיסית של הכליות ומיקום אזור קוצב PKJ.(A) תרשים של הכליה השלמה המראה את כיוון ה-RP והשופכן. עורק הכליה ווריד הכליה מוצגים באדום ובכחול, בהתאמה. (B) ניתן לחתוך את הכליה השלמה לאורך מישור קשת כדי לחשוף את האספקט הפנימי של הכליה, כולל המדולה, הפפילה (מדולה דיסטלית שבה צינורות האיסוף נפגשים), ו-RP פרוקסימלי ודיסטלי. (C) ניתן לכרות את המדו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת פטרי 60 מ"מ x 15 מ"מ	סיגמא אולדריץ'	P5481	צלחת דיסקציה חדה של הכליה
נייר סופג	פישר סיינטיפיק	06-666א	כדי לייבש את הכליה לפני המריחה דבק
ב6; 129S-Gt(ROSA)26Sor/J	מעבדת ג'קסון	13148	עכברי GCaMP3
ב6; 129S-Gt(ROSA)26Sor/J	מעבדת ג'קסון	24105	עכברי GCaMP6f
ב6. FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J	מעבדת ג'קסון	19079	עכברי smMHC-CRE
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J	מעבדת ג'קסון	13148	עכברי PDGFRa-CRE
אתנול	פאמקו-אפר	SDA 2B-6	לדיסקציה
מספריים בון עדינים במיוחד	כלים מדעיים משובחים	14083-08	משמש לניתוח מספריים פנימי
מספריים עדינים	כלים מדעיים משובחים	14060-09	משמש לניתוח חיצוני מספריים
מלקחיים עדינים	כלים מדעיים משובחים	11254-20	משמש לדיסקציה עדינה של הכליה
איזופלורן	בקסטר	NDC 1001936060	להרדמה
אלסטומר סיליקון	פישר סיינטיפיק	NC9285739	סילגארד 184
סטודנט אדסון מלקחיים	כלים מדעיים משובחים	91106-12	להחזקה והזזה עדינה של ה כליה
סטודנט Dumont מלקחיים	כלים מדעיים משובחים	91150-20	משמש למלקחיים לניתוח פנימי
מספריים קפיציים של Vannas	כלים מדעיים משובחים	15000-03	לדיסקציה חדה וניקוי של כליה מבודדת