כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת פתרונות
- הכן 1 ליטר של תמיסת קרבס-רינגר ביקרבונט (KRB) המכילה 120.35 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 15.5 mM NaHCO3, 1.2 mM Na2HPO 4,1.2 mM MgCl2, 11.5 mM גלוקוז ו-2.5 mM CaCl2. ביום השימוש, יש לשמור את תמיסת KRB על ice.
הערה: ניתן לאחסן KRB בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע, ויש לבעבע אותו מראש עם תערובת של 97% O2 ו-3% CO2 למשך 10 דקות לפחות לפני השימוש.
2. חתך ויברטומי של הכליה
- השתמש במלקחיים קהים כדי לתפוס בעדינות ולהסיר את הכליה המוכנה מתמיסת KRB הקרה כקרח. הניחו מיד את הכליה על נייר סופג למשך ~2-4 שניות כדי להסיר לחות חיצונית עודפת. גלגלו בעדינות את הכליה על פני נייר הספיגה כדי לוודא שכל צידי הפרנכימה התייבשו, כך שתהיה הדבקה אופטימלית של הכליה לשלב הוויברטום.
הערה: מכיוון שאגן הכליה ממוקם בתוך הכליה ולכן מוגן על ידי הפרנכימה החיצונית, תקופת ייבוש קצרה זו לא תזיק לשלמות הרקמות.
- יש למרוח מיד שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט (~ 1 ס"מ2) על בסיס צלחת דגימת הוויברטום, ולהשתמש במלקחיים קהים כדי להניח את הכליה, צד השופכן כלפי מטה, על האזור המכוסה בדבק. הפעילו בעדינות לחץ כלפי מטה על החלק העליון של הכליה עם הקצה השטוח של המלקחיים למשך כ-10-20 שניות כדי לייבש את הדבק.
הערה: כדי לייצב את הכליה במהלך הליך זה, השתמש בזוג מלקחיים נוסף כדי לשמור על הכליה זקופה כאשר הדבק מתייבש. זה קריטי כי הכליה נצמדת צלחת הדגימה במצב זקוף, כך חלקים נחתכים ישר. כדי להבטיח כי הכליה דבקה בהצלחה צלחת הדגימה, בעדינות לדחוף את הצד של הכליה. אם הכליה נצמדה בהצלחה לצלחת, בסיס הכליה צריך להישאר מאובטח לצלחת.
- הדקו היטב את צלחת הדגימה לתחתית מגש החיץ. התאם את רמת תמיסת KRB כך שהחלק העליון של הכליה יהיה שקוע במלואו. במהלך שלבי החיתוך, כאשר להב הוויברטומה נע עמוק יותר לתוך מגש החיץ, הסר את תמיסת KRB כך שמחזיק הלהב לא ישקע בתמיסה.
הערה: אם הדבק לא התייבש לחלוטין לפני שתמשיך בשלב זה, הדבק יעלה לעתים קרובות מהבסיס אל פרנכימה בכליות. דבק עודף זה יהפוך את חלוקת החתכים למשתנה יותר. אם זה קורה, להסיר את הכליה מהצלחת ולהמשיך עם הכנה כליה טרייה.
- לחיתוך ויברטומי אוטומטי, בחר את מיקומי ההתחלה והסיום של מחזור חיתוך להבי הוויברטום. ודא כי תנוחות אלה הן ~ 0.5-1 ס"מ נקי של הכליה כדי להבטיח כי עם כל התקדמות להב, כל מישור הכליה הוא חתך.
- הכינו צלחת מרובת בארות (24 או 48 בארות) על ידי מילוי בארות בתמיסת KRB, והניחו את הצלחת על קרח.
הערה: כאשר נוצרים, יש למקם חלקים בודדים בבארות נפרדות כדי לעקוב אחר עומק המקטע.
- התחל בתהליך החיתוך האוטומטי. במהלך המעבר הראשוני של הלהב, ודא כי הלהב יוצר מגע עם החלק העליון של הכליה. אם לא נוצר מגע, התאם את מיקום Z ההתחלתי של הלהב.
- באמצעות מלקחיים, לאסוף חלקים משוחררים מהכליה. העבירו מיד את הקטעים לבארות בודדות ושימו לב לעומק Z של הקטעים כדי לאמוד את המיקום המשוער של PKJ בתוך קטעי כליות.
הערה: בהתאם לפרמטרים לחתוך, חלקים מסוימים לא ניתן לחתוך ללא בלוק הכליות. אם זה קורה, בזהירות להשתמש מספריים קפיץ דק לחתוך חלקים מן בלוק הכליות. כמו כן, אנו מעודדים את המשתמשים לדמיין באופן פעיל חלקים תחת מיקרוסקופ אור תוך ציפה חופשית בבארות בודדות כדי להבטיח הגדרות חיתוך אופטימליות ומיקום רקמות. חלקים המכילים PKJ ייגזרו בדרך כלל ~ 1000-1500 מיקרומטר מהחלק העליון של הכליה.
- המשך את פרוטוקול החלוקה עד שאזורי PKJ יהיו ברורים יותר. עיין בסעיף תוצאות מייצגות לקבלת תיאור של אזורי PKJ כהכנסות מקטעים.
- בשלב זה, בצע אופטימיזציה של פרמטרי החתך כדי להבטיח שהחלקים משוחררים מבלוק הכליה באופן אחיד ושלמים. בנוסף, יש לוודא שאזורי ה-PKJ רציפים ובלתי שבורים מכיוון שקירות PKJ שבורים לא יאפשרו הדמיה מספקת של תאים בתוך הקיר עקב התמוטטות. אם קירות נשברים, הפחיתו את מהירות החתך והגדילו את עובי החתך והמשיכו לצפות בקטעים תחת מיקרוסקופ אור כדי לכוונן את פרמטרי החיתוך.
- יש לאחסן חלקים בטמפרטורה של 4°C בתמיסת KRB עד לתחילת הניסויים.
