מודל אורגנואיד של גידול בשלפוחית השתן: שיטה להשתלה אורתוטופית של אורגנואידים משלפוחית השתן למושתלת שלפוחית השתן

תקציר

מקור: Kim, Y. et al. תרבית, מניפולציה והשתלה אורתוטופית של אורגנואידים של גידול בשלפוחית השתן בעכבר.J. Vis. Exp.(2020)

בסרטון זה אנו מתארים השתלה אורתוטופית של אורגנואידים מגידול בשלפוחית השתן בתרבית לתוך שלפוחית השתן כדי לחקור את תפקידה של סביבת האיברים בהתפתחות גידולים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. גידולי שלפוחית השתן תת-תרבית אורגנואידים
 

הערה: מומלץ לעבור אורגנואידים של גידול בשלפוחית השתן כאשר הם מגיעים לקוטר של 100-150 מיקרומטר.

1. הוסף 500 μL של collagenase/dispase למדיום האורגנואיד בצלחת של 24 בארות עם אורגנואידים סרטניים. פיפטה מעלה ומטה את מטריצת קרום המרתף ואת המדיום. לדגור במשך 20 דקות ב 37 ° C ולקצור את התאים לתוך צינור 15 מ"ל.
   הערה: בחנו את האורגנואידים שבודדו ממטריצת קרום המרתף תחת מיקרוסקופ. אם האורגנואידים אינם מנותקים ממטריצת קרום המרתף, הגדילו את זמן הדגירה או פיפטה יותר פעמים.
2. להוסיף 5 מ"ל של DMEM שחומם מראש, לצנטריפוגה את הצינור ב 400 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, ולשאוף את supernatant.
3. השהה מחדש את הגלולה באמצעות 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA שחומם מראש ו- 10 מיקרומטר Y-27632. יש לדגור במשך 5 דקות באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. פיפטה נמרצת של התאים למעלה ולמטה ולנטרל את הטריפסין באמצעות 5 מ"ל של DMEM עם 10% FBS.
4. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C ולשאוף את supernatant.
5. להשעות מחדש את הגלולה באמצעות 1 מ"ל של מדיום אורגנואיד שחומם מראש ולספור את מספר תאי הגידול הבודדים.

2. השתלה אורתוטופית של אורגנואיד שלפוחית השתן (איור 1A)

1. הכנת אורגנואידים של גידול שלפוחית השתן להשתלה אורתוטופית
   1. לפני ההשתלה, תרבית את הגידול בשלפוחית השתן אורגנואידים במשך 5-7 ימים, כפי שתואר לעיל.
   2. הוסף 500 μL של collagenase/dispase למדיום האורגנואיד בצלחת של 24 בארות עם אורגנואידי הגידול. פיפטה מעלה ומטה את מטריצת קרום המרתף ומדיום. דגירה במשך 20 דקות ב 37 ° C ולאסוף את התאים לתוך צינור 15 מ"ל.
   3. הוסף 5 מ"ל של DMEM שחומם מראש, צנטריפוגה את הצינור ב 400 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, ושאפו את supernatant.
   4. להשעות את הגלולה עם 1 מ"ל של DMEM ולהעביר את הפתרון לתוך צלחת פטרי 90 מ"מ.
   5. תחת מיקרוסקופ, הרימו את 10-100 אורגנואידי הגידול באמצעות מיקרופיפטה P200 ואספו אותם לתוך מיקרו-צינור על קרח.
   6. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C בזהירות להשליך את supernatant.
   7. שמור את גלולת התא על קרח עד שהעכברים מוכנים לניתוח.
2. השתלת דופן שלפוחית השתן התת רירית
   1. הכינו עכבר עירום זכר בן 8 עד 10 שבועות (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) לפחות שבוע לפני הניסוי כדי לאפשר לו להתאקלם בסביבה חדשה. יש להזריק אנרופלוקסצין (5 מ"ג/ק"ג) תת עורית 24 שעות לפני ניתוח.
   2. נקו את משטח הספסל במים וסבון. בצעו אוטוקלאבים של כלי הניתוח לפני ההליך הכירורגי ובצעו את הניתוח באמצעות מכשירים סטריליים.
   3. שמור את מזרק האינסולין 29 G, קצוות פיפטה ומטריצת קרום המרתף על קרח. מתן קטופרופן (5 מ"ג/ק"ג) תת עורית לפני מתן הרדמה.
   4. מרדימים את העכבר עם 4% isoflurane בתא אינדוקציה. לאחר השגת הרדמה כללית, יש להניח את העכבר במצב שכיבה ולשמור על הרדמה על ידי שאיפת מסכה של 2% isoflurane vaporized.
      הערה: אם זמן ההרדמה הוא מעל 30 דקות, יש למרוח משחת עיניים על שתי העיניים באמצעות צמר גפן כדי למנוע התייבשות הקרנית.
   5. החל povidone-יוד עם גזה סטרילית לנגב אותו עם 70% אתנול. חזור על הפעולה 3 פעמים עם גזה חדשה או צמר גפן בכל פעם.
   6. יש לכסות את פי הטבעת ואת שדה הניתוח באמצעות וילונות כירורגיים חד פעמיים וסטריליים.
   7. בעזרת מיקרוסקופ מנתח להגדלה, מבצעים חתך רוחבי קטן (קטן מ-1.5 ס"מ) בעור ובדופן השרירית של הבטן בקו האמצע התחתון בעזרת מספריים כירורגיים סטריליים. יש לחשוף את שלפוחית השתן מחלל הבטן ולתמוך בה באמצעות צמר גפן ספוג במי מלח.
      הערה: אם שלפוחית השתן מלאה בשתן, לחץ בעדינות על שלפוחית השתן כדי לשחרר מעט את הדחיסה.
   8. השהה מחדש את כדורי האורגנואיד ב- 80 μL של תווך אורגנואיד המכיל 50% מטריצת קרום מרתף בריכוז גבוה (טבלה 1 וטבלה של חומרים).
   9. הזריקו את תרחיף האורגנואיד לתוך האספקט הקדמי של כיפת שלפוחית השתן באמצעות מזרק אינסולין 29 G תחת מיקרוסקופ נתיחה.
   10. סגור את השכבה הפנימית של דופן הבטן עם תפר נספג אנטיבקטריאלי ולאחר מכן סגור את השכבה החיצונית עם תפר ניילון 4-0. לחטא את אתר הניתוח עם פובידון-יוד ו 70% אתנול.
   11. אפשר לעכבר להתאושש תחת מקרן אינפרא אדום 10-15 דקות. עקוב אחר העכבר עד שהוא חוזר להכרה ולתנועתיות.
   12. יום לאחר הניתוח, בדוק את מצבו הכללי של העכבר ואת הדליפה האנסטומטית. יש לתת קטופרופן (5 מ"ג/ק"ג) פעם ביום במשך 3 ימים לאחר הניתוח ולטפל באנרופלוקסצין (5 מ"ג/ק"ג) פעם ביום במשך 10 ימים לאחר הניתוח.
   13. כאשר מקום החתך נרפא (10-14 ימים לאחר הניתוח), יש להסיר את התפרים. עקוב אחר צמיחת הגידול בשלפוחית השתן של העכבר במשך 2-3 שבועות לאחר הזרקת האורגנואיד של הגידול.
   14. אם נצפה גידול בשלפוחית השתן, יש להרדים את העכבר באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני, ולקצור את הגידול כולו בשלפוחית השתן. שטפו אותו באמצעות DPBS קר (איור 1B).
   15. כדי לנתח את ההיסטולוגיה של הגידול בשלפוחית השתן, הכתימו את החלק המשובץ בפרפין של הרקמה באמצעות צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) (איור 1B).

מדיום גידול בשלפוחית השתן של עכבר
DMEM/F-12 מתקדם (בינוני בסיסי)	10 מ"מ HEPES (pH 7.4)
10 מ"מ ניקוטינאמיד	תוסף 0.5x ללא סרום
2 מ"מ ל-אלניל-L-גלוטמין דיפפטיד	1% פניצילין/סטרפטומיצין
1 מ"מ N-אצטיל-L-ציסטאין	50 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמיס מורין
1 מיקרומטר A 83-01

טבלה 1: הרכב תווך אורגנואיד גידול בשלפוחית השתן.

תוצאות

איור 1: השתלה אורתוטופית של אורגנואידים של גידול בשלפוחית השתן.(A) תרשים סכמטי של השתלה אורתוטופית של אורגנואידים של גידול בשלפוחית השתן לעכבר עירום. (B) תמונות מייצגות של שלפוחית השתן וחלקים מוכתמים ב-H&E מעכברים שהושתלו באורטוטופית אורגנואידים של גידול בשלפוחית השתן. תצוגות מוגדלות של האזורים המסומנים בתיבות בחלוניות האמצעיות מוצגות בחלוניות הש...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
15 מ"ל צינור חרוטי	SPL	50015
צלחת 24 בארות	קורנינג	3526
29 גרם 1/2 מזרק אינסולין	שינה	B299473538
50 מ"ל צינור חרוטי	SPL	50050
A8301	טוקריס	2939	ריכוז במלאי: 25 mM
אתנול מוחלט	דאג'ונג	4023-2304
תפר נספג	הנרי שיין	039010
DMEM/F-12 מתקדם	תרמו	12634028
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (עכבר עירום)	Charles נהר	194
Collagenase סוג I	תרמו	17100017	ריכוז במלאי: 20 מ"ג/מ"ל
קולגנאז סוג II	תרמו	17100015	ריכוז במלאי: 20 מ"ג/מ"ל
קולגנאז/דיספאס	סיגמא	10269638001	ריכוז במלאי: 1 מ"ג/מ"ל
DMEM (המדיה החיונית המינימלית המתוקנת של Dulbecco)	גיבקו	11965-118
DMSO (דימתיל סולפוקסיד)	סיגמא	D8418
DPBS (מלח חוצץ פוספט של Dulbecco)	וולג'ין	ל"ב 001-02
גורם גדילה מופחת מטריג'ל (GFR) גורם גדילה מופחת (GFR)	קורנינג	354230	שימוש לתרבית אורגנואידים בצלחת
מטריגל ריכוז גבוה (HC)	קורנינג	354248	שימוש להשתלת אורגנואידים
מיקרו-צינור 1.5 מ"ל	אקסיגן	MCT-150-C
סכין גילוח
מאגר מלח	JW פרמצבטיקה
טריפסין-EDTA (0.25%)	גיבקו	25200072
צינור אולטרה-צנטריפוגה	בקמן קולטר	331372
Y-27632 דיהידרוכלוריד	אבמול	M1817	ריכוז במלאי: 10 mM