כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. הכנת בדיקות
- הכינו גשושיות מסגסוגת טיטניום-ניקל (אורך 40 מ"מ; קוטר 0.2 מ"מ) מצופות בסורב 7 מ"מ במצב ערבוב. מספר הבדיקות תלוי בנקודות הזמן הממוקדות במהלך ההליך כולו ובמספר העותקים המשוכפלים (3 מומלצים לכל נקודת זמן).
הערה: ניתן להתאים את אורך וסוג שלב המיצוי בהתבסס על אופן המחקר, קוטביות המטבוליטים ומטריצת הדגימה.
- הכינו תערובת ניקוי המורכבת מכלורופורם 2:1:מתנול (v/v). פיפטה 1.0 מ"ל של התמיסה לכל בקבוקון זכוכית 2.0 מ"ל ומניחים בדיקה אחת, שנוקבה בעבר דרך הכובע, בכל בקבוקון.
הערה: לפני השימוש, נקו את כל הבדיקות כדי להסיר חלקיקים מזהמים.
- הניחו את הבקבוקונים על התסיסה והגדירו את מהירות התסיסה ל-1,200 סל"ד. לאחר 45 דקות, יש להפסיק את המכשיר ולשטוף את הציפויים במים בדרגת LC-MS.
- מכיוון שציפויים חייבים לעבור שלב של התניה מוקדמת כדי להפעיל אותם, הכינו תערובת קדם-מיזוג המורכבת מ-1:1 מתנול:מים (v/v). פיפטה 1.0 מ"ל של התמיסה לכל בקבוקון זכוכית 2.0 מ"ל ומניחים בדיקה אחת, שנוקבה בעבר דרך הכובע, בכל בקבוקון.
- הניחו את הבקבוקונים על מתסיס המערבולת והגדירו את מהירות התסיסה ל-1,200 סל"ד.
- לאחר 60 דקות, עצרו את התסיסה ושטפו את הציפויים במים בדרגת LC-MS.
- יש לעקר את הבדיקות בהתאם לפרוטוקול החיטוי הסטנדרטי של ציוד כירורגי.
2. חילוץ
- יש לפתוח את האריזה הסטרילית ממש לפני הדגימה כדי להבטיח סביבה סטרילית.
- הכנס שתי בדיקות ישירות לקליפת הכליה למשך 10 דקות בכל נקודת זמן. כל אורך הציפוי חייב להיות מכוסה על ידי מטריצת הרקמות; אין צורך בזווית ספציפית, אך בדרך כלל משתמשים ב- 90 מעלות בקירוב.
הערה: ההליך הרפואי כולו מתנהל על פי פרוטוקולים סטנדרטיים במוסד נתון. לא נשקל שינוי בנוגע לדגימת SPME. ההליך כולל את שש נקודות זמן הדגימה הבאות: א) לפני כריתת כליה, in vivo מתורם; ב)–ה) לאחר 1 שעות, 3 שעות, 5 שעות, 7 שעות של זילוח כליות, ex vivo בחדר איברים; ו) לאחר רפרפוזיה, in vivo מהנמען.
- הסר את הבדיקות על ידי שליפתן מהרקמה ולאחר מכן שטוף את הציפויים במים בדרגת LC-MS כדי לנקות את שאריות הדם משטח הציפוי. יש לשטוף הרחק מאתר הניתוח, ומיד לאחר הסרת הבדיקות.
3. הובלה ואחסון
- מניחים בדיקות בבקבוקונים נפרדים וסוגרים אותם.
- הניחו את הבקבוקונים בקופסת קלקר מלאה בקרח יבש או בחנקן נוזלי להובלה.
- אחסנו דגימות במקפיא (-80°C), או התחילו מיד את שלב הספיחה.
4. ספיחה
- הכינו תמיסות ספיחה המורכבות מ-80:20 אצטוניטריל:מים (v/v) לאנליזה מטבולית, ואיזופרופנול:מתנול 1:1 (v/v) לאנליזה ליפידומית.
- פיפטה 100 μL של התמיסה כדי להכניס לתוך 2.0 מ"ל בקבוקונים מסומנים ומניחים בדיקה אחת, בעבר נוקב דרך הכובע, בכל בקבוקון.
- הניחו את הבקבוקונים על מתסיס המערבולת והגדירו את מהירות התסיסה ל-1,200 סל"ד למשך 120 דקות.
- הסר בדיקות מן הבקבוקונים. תמציות שהתקבלו מוכנות כעת לניתוח אינסטרומנטלי.
5. ניתוח LC-MS
- מניחים בקבוקונים המכילים תמציות בדוגמית האוטומטית של מערכת LC-MS.
הערה: כרומטוגרפיה נוזלית (RP, HILIC) בשילוב עם ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה ומנתח מסות אורביטרפ שימשו במחקר זה. עבור פרמטרים של ניתוח מטבולומי, עבור לשלב 5.2. עבור פרמטרים של ניתוח ליפידומי, עבור לשלב 5.6.
- השתמש בעמוד pentafluorophenyl (PFP) (2.1 מ"מ x 100 מ"מ, 3 מיקרומטר) להפרדת פאזות הפוכה.
- הגדר את קצב הזרימה ל- 300 מיקרוליטר לדקה, ואת טמפרטורות הדגימה האוטומטית והעמודה ל- 4 ° C ו- 25 ° C, בהתאמה.
- הכינו שלבים ניידים לפי הפרופורציות הבאות: שלב נייד A: מים: חומצה פורמית (99.9:0.1, v/v), ושלב נייד B: אצטוניטריל: חומצה פורמית (99.9:0.1, v/v). הגדר את זרימת הפאזה הניידת בהתאם לפרמטרים הבאים: התחלת זרימת פאזה ניידת (0-3 דקות): 100% A ואחריה שיפוע ליניארי ל-10% A (3-25 דקות), המסתיים בזרימה איזוקרטית של 10% A עד 34 דקות, ואחריה 6 דקות של זמן שיווי משקל מחדש של עמודות.
- להפרדת HILIC, השתמש בעמוד HILIC (2.0 מ"מ x 100 מ"מ, 3 מיקרומטר, 200A). הגדר את קצב הזרימה ל- 400 מיקרוליטר לדקה.
- הכינו שלבים ניידים לפי הפרופורציות הבאות: שלב נייד A: אצטוניטריל: חיץ אמוניום אצטט (9:1, v/v, ריכוז מלח אפקטיבי 20 mM), שלב נייד B: אצטוניטריל: חיץ אמוניום אצטט (1:1, v/v, ריכוז מלח אפקטיבי 20 mM).
- הגדר את זרימת הפאזה הניידת בהתאם לפרמטרים הבאים: התחל את זרימת הפאזה הניידת (0-3 דקות) ב- 100% A, החזק למשך 3.0 דקות ולאחר מכן עלה ל- 100% B תוך 5 דקות. החזק עם 100% B עד 12 דקות, ולאחר מכן 8 דקות של זמן שיווי משקל מחדש של עמודות.
- הגדר את טווח הסריקה ל- 85–1000 m/z. הגדר פרמטרים של מקור יונים HESI במצב יינון חיובי ל: מתח ריסוס 1,500 V, טמפרטורת נימים 300 °C, גז נדן 40 a.u., קצב זרימת גז aux 15 a.u., טמפרטורת מחמם בדיקה 300 °C, עדשת S רמת RF 55%.
- הפעל דגימות QC המורכבות מ -10 μL מכל דגימה מנותחת (באופן קבוע, כל 10-12 דגימות) כדי לפקח על ביצועי המכשיר.
- להפרדת פאזות הפוכה, השתמש בעמוד C18 (2.1 מ"מ x 75 מ"מ, 3.5 מיקרומטר).
- הגדר את קצב הזרימה ל- 200 מיקרוליטר לדקה, ואת טמפרטורות הדגימה האוטומטית והעמודה ל- 4 ° C ו- 55 ° C, בהתאמה. הכן שלבים ניידים לפי הפרופורציות הבאות: שלב נייד A: H2O:MeOH (60: 40, v/v), 10 mM אמוניום אצטט ו 1 mM חומצה אצטית; שלב B נייד: IPA:MeOH (90:10, v/v), 10 mM אמוניום אצטט ו-1 mM חומצה אצטית.
- הגדר את זרימת הפאזה הניידת לפי הפרמטרים הבאים: 0-1 דקות (20% B), 1-1.5 דקות (20-50% B), 1.5-7.5 דקות (50-70% B), 7.5-13 דקות (70-95% B), 13-17 דקות (95% B), 17-17.1 דקות (95-20% B), 17.1-23 דקות (20%).
- להפרדת HILIC, השתמש בעמוד HILIC (100 x 2.1 מ"מ, 3 מיקרומטר).
- הגדר את קצב הזרימה ל- 400 מיקרוליטר לדקה, ואת טמפרטורות הדגימה האוטומטית והעמודה ל- 4 ° C ו- 40 ° C, בהתאמה.
- הכן שלבים ניידים לפי הפרופורציות הבאות: שלב נייד A:ACN; שלב נייד B: 5 mM אמוניום אצטט במים. הגדר את זרימת הפאזה הניידת לפי הפרמטרים הבאים: 0-2 דקות (96% B), 2-15 דקות (96-80% B), 15-15.1 דקות (80-96% B), 15.1-21 דקות (96% B).
- הגדר פרמטרים של מקור יונים HESI במצב יינון חיובי למתח ריסוס 3,500 V, טמפרטורת נימים 275 °C, גז נדן 20 a.u., קצב זרימת גז aux 10 a.u., טמפרטורת מחמם בדיקה 300 °C, רמת RF עדשת S 55%.
- הפעל דגימות QC המורכבות מ- 10 μL מכל דגימה שנותחה (כל 10-12 דגימות) כדי לפקח על ביצועי המכשיר.
- ביצוע איסוף נתונים בתוכנה תואמת המכשיר.
6. ניתוח נתונים
- לבצע עיבוד נתונים, זיהוי משוער וניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה ייעודית לניתוח מטבולומיקה וליפידומיה לא ממוקדת.
הערה: ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) וחלקות שפם קופסה ניתן להשיג כדי להמחיש את מבנה הנתונים.
