צביעת DNA חוץ-תאית: שיטה לזיהוי DNA חוץ-תאי בקטעי רקמת FFPE

תקציר

מקור: O'Sullivan, K. M. et al. Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מתאר את הטכניקה של צביעת DNA חוץ-תאי בקטעי רקמת FFPE. ניתן לכמת את הדנ"א החוץ תאי המוכתם כדי לקבוע את יעילותו של כל טיפול טיפולי שמוביל למוות של תאים סרטניים.

פרוטוקול

1. צביעה עבור ecDNA עם DAPI ו- β-Actin

1. הכניסו את מגלשות הזכוכית למתלה שקופיות בתנור בטמפרטורה של 60°C למשך 60 דקות.
2. יש לטבול את המגלשות בשני מחליפים של ממס (קסילן או תחליף) למשך 40 דקות כל אחד, בתוך מכסה אדים.
3. התייבשות מחליקות ב-100% אתנול, 100% אתנול ו-70% אתנול למשך 5 דקות כל אחת. יש לשטוף במשך 5 דקות במי ברז.
4. מניחים פלטה חמה במכסה אדים ותמיסת אחזור אנטיגן טרום רתיחה (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 9.0) בסיר לחץ. ברגע שתמיסת שליפת האנטיגן מתחילה לרתיחה, מניחים את המגלשות בסיר בצורה אופקית באמצעות זוג מלקחיים ונועלים את המכסה. מרתיחים על רמה גבוהה (שווה ערך ל-15 psi או 103 kPa) למשך 10 דקות
   הערה: שלב זה הוא קריטי מכיוון שהוא שולף את האנטיגן המעניין על ידי חשיפת אפיטופ האנטיגן (מקושר באמצעות קיבוע פורמלין) כדי לאפשר קשירה ספציפית לנוגדן אפיטופ; הצביעה הבאה לא תעבוד בלעדיו.
5. הסירו את סיר הלחץ מהאש והסירו את המכסה מיד על ידי הפעלת ברז קר על גבי המכסה בכיור. השאר שקופיות לאיזון למשך 20 דקות בתמיסת אחזור האנטיגן.
6. יש לשטוף שקופיות פעמיים במשך 5 דקות במי מלח חוצצי פוספט באורך 0.01 מ' (PBS) (pH 7.4) על שייקר מסלולי.
7. השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר עיגולים סביב רקמת הכליה, נזהר לא לתת לשום רקמה להתייבש בזמן זה.
8. לחסום רקמה ב-10% סרה עוף באלבומין 5% בסרום בקר (BSA)/PBS (pH 7.4, 0.01 M) למשך 30 דקות, 60 מיקרוליטר לכל קטע. אין לשטוף לאחר שלב זה אלא להסיר בזהירות את הפתרון החוסם באמצעות פיפטה 60 μL, לא נותנים את החלקים להתייבש.
9. יש למרוח קוקטייל נוגדנים ראשוני עבור β-אקטין מדולל 1/1000 ב-1% BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M), 60 μL לכל חתך ולדגור למשך הלילה בתא לחות ב-4°C.
10. שטפו שקופיות פעמיים במשך 5 דקות ב-PBS (pH 7.4, 0.01 מטר) על שייקר מסלולי.
11. יש למרוח נוגדן משני, עוף נגד ארנב 488 (1/200), 60 μL לכל קטע מדולל ב-1% BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) למשך 40 דקות ב-RT.
12. שטפו את המגלשות פעמיים במשך 5 דקות ב-PBS (pH 7.4, 0.01 M) על שייקר מסלולי.
13. לטבול את המגלשות ב-0.3% סודן שחור באתנול 70% למשך 30 דקות בצנצנת Coplin.
    הערה: שלב זה חשוב מכיוון שהוא מרווה את האוטופלואורסנציה הנגרמת על ידי קיבוע פורמלין.
14. שטפו את המגלשות במי ברז כדי להסיר משקעים ולאחר מכן טבלו ב-PBS (pH 7.4, 0.01 M) למשך 10 דקות כדי למנוע היווצרות משקעים שחורים נוספים.
15. הרכבה מחליקה על כיסויי זכוכית קונפוקלית באמצעות שלוש טיפות 60 μL של תמיסת הרכבה עם DAPI ואוטמת את הכיסויים עם לק על ידי מריחת מסביב להיקף הכיסוי.
16. אפשר לשקופיות להירפא למשך 24 שעות ב- RT (כדי לאפשר ל- DAPI לחדור) ולאחר מכן אחסן ב- 4 °C מוגן מפני אור.
    הערה: חשוב לשמור בחושך כדי למנוע דעיכה של בדיקות פלורסנט.
17. שקופיות תמונה באמצעות ראש סריקת לייזר קונפוקלי המחובר למיקרוסקופ. הרגש שקופיות עם לייזר 405 עבור DAPI ולייזר 488 עבור בטא אקטין . צלם תמונות במישור יחיד של 1024 x 1024 פיקסלים באמצעות לכידה רציפה של קו וממוצע של 4 שורות, החיוניים לזיהוי ecDNA. 40x 1.0 NA המטרה שמן משמש.
    1. תמונה מינימום של 20 glomeruli לכל דגימה. שמור תמונות כקובצי ND2.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אלבומין בסרום בקר	סיגמא	A2153	תמיסות 5% ו -1% מורכבות ב- PBS, ניתן לייצר בכמויות גדולות ולהקפיא - להשליך לאחר הפשרה
עוף נגד עיזים IgG (H+L) נוגדן נספג צולב Alexa Fluor 594	תרמופישר סיינטיפיק	A-21468	יש לסובב במיני צנטריפוגה למשך דקה אחת לפני השימוש כדי למנוע הצמדה חופשית בקוקטייל הנוגדנים
נוגדן נגד עכבר עוף IgG (H+L) נספג צולב, אלכס פלואור 647	תרמופישר סיינטיפיק	A-121468	יש לסובב במיני צנטריפוגה למשך דקה אחת לפני השימוש כדי למנוע הצמדה חופשית בקוקטייל הנוגדנים
עוף נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן נספג צולב Alexa Fluor 488	תרמופישר סיינטיפיק	A-21441	יש לסובב במיני צנטריפוגה למשך דקה אחת לפני השימוש כדי למנוע הצמדה חופשית בקוקטייל הנוגדנים
סרה עוף	סיגמא	C5405	מורכב מ-1% BSA/PBS
כיסויים 24x60 מ"מ	Azerscientific	ES0107222	#1.5 זה לא עובי סטנדרטי המיועד לשימוש במיקרוסקופ קונפוקלי
EDTA 10mM	סיגמא	E6758	הוסף TRIS ו- EDTA יחד במים מזוקקים ו- pH ל- 9, לשליפת אנטיגן, ניתן להשלים בתמיסה פי 10
אתנול 30%, 70% ו-100%	אספקת כימיה	UN1170	מסופק כאתנול 100% לא מפורק - מדולל ל-30% ו-70% באמצעות מים מזוקקים
פורמלדהיד, 4% (10% פורמלין חוצץ נייטרלי)	טריאנוס	NBF-500	הכליה מוכנסת לצינור 5 מ"ל המכיל 3 מ"ל פורמלין למשך 16 שעות ב- RT, יש להשתמש בפורמלין במכסה אדים
שקופיות היסטולוגיה מזכוכית- Ultra Super Frost, זיגוג מנזל, 25x75x1.0 מ"מ	טריאנוס	J3800AM4	שימוש בשקופיות מצופות טעונות חיובי הוא חיוני. אנו לא ממליצים להשתמש בפולי-L-ליזין לציפוי שקופיות כאשר רקמות מתנתקות משקופיות בשלב שליפת האנטיגן
נוגדן MPO נגד אדם/עכבר עיזים	מו"פ	AF3667	Aliquot ולהקפיא ב מינוס 80 מעלות עם ההגעה
עט הידרופובי	מעבדות וקטור	H-400	השתמש כדי לצייר עיגול סביב רקמת הכליה
פוספט חוצץ מלוחים	סיגמא	P38135	0.01M PB/0.09% NaCl איפור 5L בכל פעם
סיר לחץ 6L Tefal מאובטח 5 נירוסטה Neo	טפל	GSA-P2530738	נרכש בחנות כלי בית מקומית
הארכת זהב DAPI	לייף טכנולוגיות	P36962	יש למרוח טיפות ישירות על הכיסוי
ארנב נוגדן בטא אקטין נגד אדם/עכבר	ABCAM	dorit_19977	Aliquot ולהקפיא ב מינוס 80 מעלות עם ההגעה
ארנב נוגדן H3Cit נגד אדם/עכבר	ABCAM	dorit_1977	Aliquot ולהקפיא ב מינוס 80 מעלות עם ההגעה
מתלה צביעה 24 שקופיות	פרוסייטק	H4465	מתלה צביעה שנבחר צריך להיות מסוגל לעמוד בהרתחה תחת לחץ ודגירת תנור 60 מעלות
סודאן בלאק ב	סיגמא	199664	0.3% יש להוסיף 3 גרם לבקבוק 1 ליטר באתנול 70%, לסנן ולהגן מפני האור - יציב למשך 6 חודשים בטמפרטורת החדר
טריס 10mM	סיגמא	T4661	הוסף TRIS ו- EDTA יחד במים מזוקקים ו- pH ל- 9, לשליפת אנטיגן, ניתן להשלים בתמיסה פי 10
קסילן	טריאנוס	XL005/20	יש להשתמש במכסה אדים