הפקת פודוציטים בכליות אנושיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים: הליך להבחנה מכוונת של פודוציטים בוגרים בכליות מתאי גזע

תקציר

מקור: Burt, M. et al. התמיינות מודרכת של פודוציטים בוגרים בכליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם בתנאים כימיים. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה, אנו מתארים את הפרוטוקול להפקת פודוציטים בכליות אנושיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים באמצעות התמיינות תאים בתנאים כימיים מוגדרים. הפודוציטים שנוצרו יכולים לשמש לבדיקת נפרוטוקסיות ומידול מחלות.

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים

1. תוסף מדיה 5x hiPS מופשר של תרבית תאים (CCM) במדיום בסיסי של תרבית תאי hiPS כדי לקבל תמיסה 1x של hiPS CCM.
   הערה: תוסף קפוא 5x hiPS CCM דורש תהליך הפשרה איטי, באופן אידיאלי ב-4°C למשך הלילה. Aliquots של 1x hiPS CCM ניתן לאחסן עד 6 חודשים ב -20 ° C.
2. הכנת לוחות ממברנת מרתף (BM) מטריצת 1 מצופים לתרבית תאי hiPS: הפשרת מטריצת BM 1 לילה על קרח ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, להכין aliquots עם גורמי דילול מתאימים כפי שהוצע על ידי היצרן.
   הערה: בדרך כלל, aliquots מוכנים לדילול הבא ב 25 מ"ל של DMEM קר / F12 בצינור חרוטי 50 מ"ל ואחריו ערבוב יסודי כדי להמיס לחלוטין את מטריצת BM 1 ולמנוע היווצרות של גבישים שיורית.
3. מעבירים 1 מ"ל של תמיסת BM matrix 1 לכל באר של צלחת 6 בארות ודגרים ב 37 ° C במשך 1-2 שעות או ב 4 ° C במשך מינימום של 24 שעות, עטוף בסרט פרפין. ניתן לאחסן את לוחות BM matrix 1-coated בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
4. הכנת לוחות מטריצת ממברנת מרתף (BM) 2 מצופים: יש לדלל כמויות מתאימות של מטריצת BM 2 ב-9 מ"ל מים מזוקקים סטריליים להכנת ריכוז סופי של 5 מק"ג/מ"ל. הוסף 700 μL של תמיסת BM matrix 2 לכל באר של צלחת 12 בארות ודגר על הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעתיים או לילה ב 4 ° C.
5. הכינו תמיסות מלאי של 100 מיקרוגרם/מ"ל כל אחת מ-BMP7, Activin A ו-VEGF באופן הבא: הרכיבו מחדש את BMP7 במים מזוקקים סטריליים המכילים 0.1% (wt/vol) BSA ובנו מחדש את Activin A ו-VEGF בנפרד ב-PBS סטרילי המכיל 0.1% (wt/vol) BSA. כדי להימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה תכופים, הכינו 100 μL aliquots מכל תמיסת מלאי ואחסנו בטמפרטורה של -20°C למשך עד 6 חודשים.
6. הכינו תמיסת מלאי של 10 מ"מ של Y27632 על ידי המסת 10 מ"ג של Y27632 ב-3.079 מ"ל מים מזוקקים סטריליים. Aliquot 100 μL מן המלאי ולאחסן ב -20 °C למשך עד 6 חודשים.
7. יש להמיס 2 מ"ג של CHIR99021 ב-143.4 מיקרוליטר של DMSO סטרילי להכנת תמיסת מלאי של 30 מילימטר. להכין 5 μL aliquots ולאחסן ב -20 ° C עד 1 חודש (או על פי המלצת היצרן).
8. להמיס 10 מ"ג של חומצה רטינואית all-trans ב 3.33 מ"ל DMSO סטרילי. להכין 500 μL aliquots ולאחסן ב -20 ° C עד 6 חודשים.

2. הכנת מדיה תרבותית

1. הכן את מדיום התמיינות המזודרם על ידי בנייה מחדש של תמיסות מלאי מתאימות לריכוז סופי של 100 ננוגרם/מ"ל Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 ותוסף 1x B27 ללא סרום בנפח מתאים של DMEM/12 עם תוסף גלוטמין.
   הערה: יש להכין את מדיום התמיינות המזודרם לפני שלבי ההתמיינות ובנפח המתאים לקנה המידה של הניסוי (בדרך כלל, 50 מ"ל של מדיום מספיקים לשני לוחות של 12 בארות).
2. הכן מדיום התמיינות ביניים של מזודרם על ידי הרכבה מחדש של תמיסות מלאי מתאימות לריכוז סופי של 100 ננוגרם/מ"ל BMP7, 3 מיקרומטר CHIR99021 ותוסף 1x B27 ללא סרום ב-DMEM/F12 עם תוסף גלוטמין.
   הערה: במידת הצורך, ניתן להשלים את המדיום עם 1% (vol/vol) פניצילין-סטרפטומיצין. התאם את עוצמת הקול של המדיום באמצעות DMEM/F12 עם תוסף גלוטמין. מדיום זה יכול להיות מוכן בקבוצות גדולות; עם זאת, מומלץ לאחסן באליציטוטים קטנים יותר (למשל, 45 מ"ל בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל) כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים. ניתן לאחסן מדיה זו ב -20 ° C עד 3 חודשים וניתן להפשיר ב 4 ° C לילה לפני השימוש.
3. הכן את מדיום השראת הפודוציטים על ידי הרכבה מחדש לריכוז סופי 100 ng/mL BMP7, 100 ng/mL activin A, 50 ng/mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 ללא תוספת סרום ו-0.1 μM all-trans retinoic acid ב-DMEM/F12 עם תוסף גלוטמין. יש להגן על חומר בינוני מפני אור (למשל, על-ידי עטיפת מיכל בנייר כסף).
   הערה: מדיום זה יכול להיות מוכן בקבוצות גדולות ומאוחסן בחושך ב -20 ° C למשך עד 3 חודשים. יש להפשיר את האליציטוטים הקפואים למשך הלילה ב-4°C לפני השימוש.
4. הכן 25 מ"ל של תמיסת נטרול טריפסין על ידי הוספת FBS מומת חום 10% (vol/vol) ב- DMEM/F12 וסנן בתנאים סטריליים.
5. לתחזוקה לאחר התמיינות של פודוציטים שמקורם בתאי גזע, הכינו את Complete Medium עם תחזוקת פודוציטים על ידי הוספת התוסף למדיום הבסיסי בהתאם להנחיות היצרן, ואחסנו בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.

3. תרבית תאי hiPS ללא הזנה באמצעות מדיום תרבית תאי hiPS

1. שאפו את התמיסה השיורית של מטריצת BM 1 מהלוחות המצופים מראש ושטפו את הבארות 3 פעמים עם 1 עד 2 מ"ל של DMEM / F12 מחומם.
2. לשאוף hiPS CCM מתאי hiPS ולשטוף את התאים 3 פעמים עם DMEM/F12 מחומם. הוסף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים חמים ודגר במשך דקה אחת ב 37 ° C כדי לעזור לנתק את התאים. לבצע בדיקה חזותית של התאים תחת מיקרוסקופ תרבית רקמה ולוודא כי הקצוות של מושבות התאים נראים מעוגלים, ולאחר מכן במהירות לשאוף את תמיסת ניתוק התא מן התאים (להבטיח כי מושבות התא עדיין מחוברות לצלחת, אם כי באופן רופף). שטפו בעדינות תאים פעם אחת עם DMEM/F12 כדי להסיר את תמיסת ניתוק התא.
3. הוסף 3 מ"ל של hiPS CCM לתאי hiPS (בכל באר של צלחת 6 בארות) שטופלו בתמיסת ניתוק התא. יש לגרד מושבות באמצעות מרים תאים, ולהעביר בעדינות את תאי פיפטה למעלה ולמטה כדי לעקור את התאים הדבוקים באופן רופף. שטפו את הצלחת ביסודיות כדי להבטיח שכל התאים נקטפו.
   הערה: מומלץ להשתמש בפיפטה של 5 מ"ל כדי למנוע גזירה עודפת על התאים.
4. העבר 0.5 מ"ל של תרחיף התא לכל באר של מטריצת BM חדשה מצופה 1 צלחת 6 בארות המכילה 2 מ"ל של hiPS CCM לכל באר. הזיזו את הצלחת בצורה של איור שמונה כדי לפזר מושבות תאים בתוך בארות ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% CO₂. יש לרענן מדיום מדי יום עד שהתאים מוכנים למעבר או לשימוש בניסוי ההתמיינות (כ-70% מפגש).
   הערה: גודל המושבה האידיאלי למעבר שגרתי של iPSCs הוא בין 200-500 מיקרומטר בתנאים נטולי מזין באמצעות hiPS CCM (ללא מעכב ROCK). אם התאים מותאמים אישית במהלך הטיפול עם אנזימי דיסוציאציה או חוצצים, ניתן להשלים את hiPS CCM עם מעכב ROCK (למשל, 10 מיקרומטר Y27632) כדי לשפר את יכולת הקיום של התא.

4. התמיינות תאי hiPS לתאי מזודרם (ימים 0-2)

1. בעוד תרביות תאי hiPS נמצאות בשלב הגידול המעריכי (בערך תוך 4 ימים מהתרבית לאחר המעבר, וכ -70% מפגש), בדוק חזותית נוכחות של תאים ממוינים באופן ספונטני בתוך ומסביב לקצוות המושבות. במידת הצורך, יש לגרד אזורים של בידול.
2. שאפו hiPS CCM מתאי hiPS ושטפו את התאים 3 פעמים עם DMEM/F12 חם. לדגור על התאים עם 1 מ"ל של מאגר דיסוציאציה תאים ללא אנזימים במשך 10 דקות ב 37 ° C ולבדוק את הדיסוציאציה תחת מיקרוסקופ. בשל הבדלים מובנים בין קווי תאי hiPS שונים, יש לקבוע את זמן הדגירה בפועל עבור מאגר הדיסוציאציה של התא עבור קו תאים נתון.
3. גרדו בעדינות את הבאר עם מרים תאים כדי לעקור תאים שהודבקו באופן רופף והעבירו את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל, ולאחר מכן צנרת מעלה ומטה מספר פעמים כדי להתאים את תאי hiPS לאינדיבידואלים.
   1. הביאו את מתלי התאים לנפח של 15 מ"ל עם DMEM/F12 חם וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-290 x גרם בטמפרטורת החדר.
   2. שאפו בעדינות את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים עם DMEM/F12 חם לסבב נוסף של צנטריפוגה כדי להסיר שאריות BM מטריצת 1 ורכיבי חיץ דיסוציאציה.
4. לשאוף את supernatant ו resuspend תאים ב 1 מ"ל של מדיום אינדוקציה mesoderm כמתואר לעיל. ספור את המספר הכולל של תאים באמצעות hemocytometer או מונה קולטר כדי לקבוע את הנפח המתאים של מדיום התמיינות mesoderm הדרוש כדי להשיג ריכוז של 1 x 10⁵ תאים / מ"ל.
5. שאפו תמיסת ECM מהלוחות המצופים 2 של BM matrix ושטפו את הלוחות פעמיים עם DMEM/F12 חם. ערבבו את מתלה תאי hiPS בעדינות על ידי פיפטינג מספר פעמים. העבר 1 מ"ל של תרחיף התא לכל באר של מטריצת BM 2 מצופים 12 צלחות באר ולאחר מכן בעדינות לנער את הצלחות כדי להפיץ את התאים באופן שווה יותר.
6. לדגור על הצלחת ב 37 ° C באינקובטור 5% CO₂. רענן את מדיום השראת המזודרם למחרת.
   הערה: לאחר יומיים, תאי מזודרם שמקורם בתאי hiPS יהיו מוכנים להשראת מזודרם ביניים.

5. התמיינות תאי מזודרם שמקורם בתאי hiPS למזודרם ביניים (ימים 2–16)

1. ביום השני של פרוטוקול הדיפרנציאציה, לשאוף מדיום השראת מזודרם ולחדש עם 1 מ"ל לכל מדיום השראת מזודרם ביניים היטב.
2. רענן את המדיום מדי יום כדי לשמור על סף מדויק של גורמי גדילה ומולקולות קטנות עבור התאים הפעילים מטבולית. אם יש גידול תאים משמעותי ודלדול מהיר של חומרים מזינים מדיה (מסומן על ידי הצהבה של התקשורת), נפח של בינוני mesoderm התמיינות בינוני ניתן להגדיל ל 1.3 מ"ל לכל באר של 12 צלחות באר
.
3. תרבית תאים למשך 14 יום נוספים לקבלת תאי מזודרם ביניים. ביום ה-16, תאים אלה יכולים להישמר בהקפאה לשימוש מאוחר יותר.

6. התמיינות תאי מזודרם ביניים שמקורם בתאי hiPS לפודוציטים (ימים 16-21)

1. שטפו את תאי המזודרם המתווכים עם DMEM/F12 חם ולאחר מכן דגירה של התאים עם 0.5 מ"ל לבאר של 0.05% טריפסין-EDTA במשך 3 דקות ב 37°C. בצע בדיקה חזותית כדי להבטיח שהתאים מתחילים להתנתק.
2. גירוד תאים באמצעות מרים תאים ופיפטה תרחיף התא מספר פעמים באמצעות קצה פיפטה 1,000 μL כדי לקבל תאים בודדים (או גושים קטנים של).
   הערה: בשלב זה, ודא שהתאים מנותקים לחלוטין מכיוון שתאים מצטברים עלולים להיכשל בהשגת פנוטיפ ממוין סופני בתוך ציר הזמן של הפרוטוקול.
3. הוסף כ 2 מ"ל לכל באר של תמיסה מנטרלת טריפסין כדי לעצור את הפעילות של טריפסין.
4. העבר תאים לצינור חרוטי של 50 מ"ל והבא את נפח התא עד 50 מ"ל באמצעות DMEM/F12, ולאחר מכן בצע צנטריפוגה של תרחיף התא למשך 5 דקות במהירות של 201 x גרם בטמפרטורת החדר.
5. לשאוף את supernatant ו resuspend תאים בתווך אינדוקציה פודוציטים. לקבלת תוצאות מיטביות, יש להבטיח צפיפות זריעה סופית של כ-100,000 תאים/באר של צלחת בת 12 בארות. הוסיפו את מתלה התא ללוחות המצופים ב-BM matrix 2 ונערו בעדינות את הצלחת כדי לסייע בפיזור התאים באופן שווה יותר.
6. לדגור על תאים ב 37 ° C ו 5% CO₂ ולרענן בינוני מדי יום עד 5 ימים כדי לקבל פודוציטים עד יום 21.
   הערה: הפודוציטים שמקורם בתאי hiPS המתקבלים יכולים להישמר בתרבית במשך 2-4 שבועות נוספים על ידי שימוש בתווך מלא עם תחזוקת פודוציטים. ברגע שהם נמצאים בתחזוקת פודוציטים, ניתן להזין את התאים אחת ליומיים וניתן להשתמש בהם למחקרים הבאים או לניתוחים במורד הזרם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תאים
תאי iPS אנושיים DU11			קו תאי ה- iPS DU11 (שיבוט אוניברסיטת דיוק #11) נוצר במתקן הליבה iPSC של אוניברסיטת דיוק וסופק לנו על ידי מעבדת Bursac באוניברסיטת דיוק. קו זה נבדק עבור מיקופלסמה ובוצע לאחרונה בקריוטיפ ביולי 2019 על ידי המעבדה שלנו, ונמצא תקין מבחינה קריוטיפית.
גורמי גדילה ותוספי מדיה
חומצה רטינואית All-trans (500 מ"ג)	72262	טכנולוגיות תאי גזע
תוסף ללא סרום B27	17504044	טכנולוגיות תרמו/לייף
CHIR99021	04-0004	סטמג'נט	עשוי להציג וריאציה מלוט להרבה
ערכה בינונית מלאה עם CultureBoost-R	4Z0-500-R	מערכות תאים	מדיית תחזוקת פודוציטים
DMEM/F12	12634028	טכנולוגיות תרמו/לייף
DMEM/F12 עם תוסף GlutaMAX	10565042	טכנולוגיות תרמו/לייף	DMEM/F12 עם תוסף גלוטמין
FBS מומת חום	10082147	טכנולוגיות תרמו/לייף
פעילות אנושית א'	PHC9564	טכנולוגיות תרמו/לייף
BMP7 אנושי	PHC9544	טכנולוגיות תרמו/לייף
VEGF אנושי	PHC9394	טכנולוגיות תרמו/לייף
mTeSR1 בינוני	05850	טכנולוגיות תאי גזע	מדיה לתרבית תאי hiPS (CCM)
פניצילין-סטרפטומיצין, נוזלי (100×)	15140-163	טכנולוגיות תרמו/לייף
מעכב רוק Y27632	1254	טוקריס
נוגדנים
נוגדנים משניים מצומדים של Alexa Fluor 488- ו- Alexa Fluor 594	A32744; A32754; A-11076; A32790	טכנולוגיות תרמו/לייף
Brachyury(T)	dorit_20680	אבקאם
נפרין	GP-N2	פרוגן
אוק4	AF1759	מערכות מו"פ
PAX2	71-6000	Invitrogen
WT1	MAB4234	מיליפור
מולקולות ECM
מקטע iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8)	N-892012	Iwai, צפון אמריקה	מטריצת קרום מרתף (BM) 2
מטריצה בעלת אישור hESC מבית Matrigel, בקבוקון 5 מ"ל	354277	BD Biosciences	מטריצת קרום מרתף (BM) 1. עשוי להציג וריאציה מלוט להרבה
אנזימים וריאגנטים אחרים
אקוטאזה	A1110501	טכנולוגיות תרמו/לייף	פתרון ניתוק תאים
BSA	A9418	סיגמא-אולדריץ'
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	D2438	סיגמא-אולדריץ'	DMSO הוא רעיל. יש לטפל במכסה מנוע בטיחות כימי
מאגר דיסוציאציה של תאים ללא אנזימים, המלח המאוזן של האנק	13150016	טכנולוגיות תרמו/לייף
תמיסת אתנול, 70% (vol/vol), כיתה ביוטכנולוגית	97065-058	VWR	אתנול הוא דליק ורעיל
פ.ב.ס.	431097	קורנינג
פרפורמאלדהיד (PFA)	28906	טכנולוגיות תרמו/לייף	יש לטפל ב-PFA במכסה מנוע כימי עם ציוד הגנה אישי מתאים, כולל כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי ראייה. יש להימנע משאיפה וממגע עם העור.
מלח חוצץ פוספט (PBS)	14190-250	טכנולוגיות תרמו/לייף
מים מזוקקים סטריליים	15230162	טכנולוגיות תרמו/לייף
טריטון X-100	97062-208	VWR
טריפסין-EDTA, 0.05%	25300-120	טכנולוגיות תרמו/לייף
ציוד
פיפטות שואפות, עטופות בנפרד	29442-462	קורנינג
Avanti J-15R צנטריפוגה	B99516	בקמן קולטר
צינור צנטריפוגה חרוטית, 15 מ"ל	352097	קורנינג
צינור צנטריפוגה חרוטית, 50 מ"ל	352098	קורנינג
תיבות קריובוקס	3395465	טכנולוגיות תרמו/לייף	לאחסון aliquots קפואים
EVOS M7000	AMF7000	טכנולוגיות תרמו/לייף	מיקרוסקופ פלורסנטי המשמש לרכישת תמונות של תאי iPS קבועים ומוכתמים ונגזרותיהם
המוציטומטר	100503-092	VWR
חממת Heracell VIOS 160i CO2	51030403	טכנולוגיות תרמו/לייף	לתרבית שגרתית ולתחזוקה של תאי iPS ונגזרותיהם
Zeiss הפוך Axio Observer מצויד במצלמת AxioCam 503	491916-0001-000 (מיקרוסקופ) ; 426558-0000-000(מצלמה)	קרל זיס מיקרוסקופיה	משמש לרכישת תמונות ניגודיות פאזה של תאי iPS חיים ונגזרותיהם בכל שלב של התמיינות פודוציטים
כפפות ניטריל של קימברלי-קלארק	40101-346	VWR
קימגבונים, גדולים	21905-049	VWR
Kimwipes, קטן	21905-026	VWR
קצוות פיפטה מחסום מדויקים P10	P1096-FR	דנוויל סיינטיפיק
קצוות פיפטה מחסום P100	עמ' 1125	דנוויל סיינטיפיק
קצוות פיפטת מחסום P1000	עמ' 1126	דנוויל סיינטיפיק
קצוות פיפטת מחסום P20	עמ' 1121	דנוויל סיינטיפיק
קצוות פיפטת מחסום P200	עמ' 1122	דנוויל סיינטיפיק
פיפטה סרולוגית, 10 מ"ל, עטופה בנפרד	356551	קורנינג
פיפטה סרולוגית, 25 מ"ל, עטופה בנפרד	356525	קורנינג
פיפטה סרולוגית, 5 מ"ל, עטופה בנפרד	356543	קורנינג
סטריפליפ, 0.22 מיקרומטר, PES	SCGP00525	EMD Millipore
צינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים	1138W14	תומאס סיינטיפיק	לציטוט גורמי גדילה
תרבית רקמות – צלחות 12 בארות מטופלות	353043	קורנינג
תרבית רקמות – צלחות 6 בארות מטופלות	353046	קורנינג
ציפוי מעבדה לבן של VWR techuni	10141-342	VWR
מרים תאים בעל שיפוע רחב	3008	קורנינג