בידוד תאי שריר חלק Detrusor: הליך עיכול אנזימטי להשגת תאי DSM מדגימות שלפוחית השתן האנושית

תקציר

מקור: Malysz, J. et al. הכנה וניצול של תאי שריר חלק אנושיים שבודדו זה עתה לאפיון זרמי קטיון רגישים 9-פננתרול. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה, אנו מדגימים את הבידוד של תאי שריר חלק detrusor מדגימות שלפוחית השתן האנושית באמצעות טיפול אנזימטי רציף דו-שלבי.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. דיסקציה של רקמות DSM והכנת פיסות DSM ללא רירית

1. בחנו את דגימת שלפוחית השתן בעובי מלא שהגיעה למעבדה מחדר הניתוח במיכל אטום היטב מלא בתמיסת דיסקציה/עיכול קרה (איור 1 וטבלה 1 להרכב DS).
   הערה: הדגימה נשמרת בדרך כלל ב-DS קר מכמה שעות ועד לילה לפני ההגעה למעבדה. לאחסון ארוך יותר, DS (טבלה 1) מתווספת ל-1 mM CaCl₂.
2. הסר ושטוף את דגימת ה- DSM האנושית בעובי מלא (המכילה את כל השכבות כולל רירית, DSM וסרוסה) עם DS קר כקרח כדי לשטוף את הפסולת והדם המצורפים.
3. נעצו את דגימת שלפוחית השתן, רירית הפונה כלפי מעלה וסרוסה כלפי מטה, על צלחת עגולה מצופה אננטיומר סיליקון (טבלה של חומרים) בקוטר 150 מ"מ מלאה ב-DS קר כקרח (איור 1B).
4. הסר את רקמת השומן, כלי הדם, האפיתל (אורותל) ורירית השרירים הסמוכים מהדגימה על ידי דיסקציה חדה באמצעות מספריים ומלקחיים.
5. גזרו החוצה כמה פיסות DSM נטולות רירית (~2-3 מ"מ אורך ו-4-6 מ"מ רוחב) (איור 1C).

2. דיסוציאציה אנזימטית של פיסות DSM המניבות תאי DSM בודדים טריים

1. הניחו 3 עד 6 חתיכות DSM לתוך צינור המכיל 1 עד 2 מ"ל DS שחומם מראש (~37°C) המכיל פפאין ודיתיותרייטול (DS-P, טבלה 1) ודגרו על חתיכות DSM ב-DS-P למשך 30-45 דקות ב~37°C, תוך ניעור עדין של הצינור מדי פעם (אחת ל-10-15 דקות).
   הערה: כדי לשלוט באופן אופטימלי בטמפרטורה לצורך טיפול אנזימטי, צינורות עם חתיכות רקמה ותמיסות אנזימים ממוקמים בתא רקמת זכוכית מלא במים שמחוברים לאמבט מים מחומם במחזור הדם (איור 1D) או באמבט מים מטלטל בדיוק גבוה ומבוקר טמפרטורה (איור 1E).
2. הסר DS-P מהשפופרת, שטוף לזמן קצר חתיכות DSM עם DS קר כקרח, השליך DS קר מהצינור והשאיר חתיכות DSM יושבות בתחתית הצינור
.
3. הוסף 1 עד 2 מ"ל של collagenase סוג II (DS-C, טבלה 1) המכיל DSM עם חתיכות DSM; ערבבו ודגרו בעדינות במשך 25-40 דקות ב~37°C, תוך ניעור עדין של הצינור מדי פעם (כל 10-15 דקות).
4. השליכו את DS-C ושטפו חתיכות DSM שטופלו באנזימים 5-10 פעמים עם DS קר כקרח.
5. לאחר השטיפה האחרונה, השאירו את תמיסת DS בתוך הצינור; טרטורו בעדינות עם פיפטת פסטר מלוטשת באש מספר פעמים כדי לשחרר תאי DSM בודדים.
6. הניחו כמה טיפות של תמיסת DS המכילה תאי DSM מפוזרים על תא תחתון זכוכית או על מכסה ובדקו ויזואלית את האיכות תחת מיקרוסקופ (באמצעות מטרה של 20x או 40x) לאחר 5 דקות לפחות לאחר היישום כדי לאפשר לתאים להיצמד לתחתית.
7. השתמש מיד בתאי DSM טריים שבודדו לניסויים אלקטרופיזיולוגיים או אחסן את התאים בצינור המכיל DS ב~ 4 ° C על קרח או במקרר עד לשימוש (בדרך כלל עד 8 שעות של הכנה).
   הערה: בתוך אותה הכנה, איכות התאים משתנה מתאי DSM מתים בעלי יכולת קיימא גבוהה לתאי DSM מתים ומעוכלים יתר על המידה (איור 2). כאשר שיטת פפאין-קולגנאז רציפה מניבה מספר גבוה מאוד של תאים שאינם ברי קיימא, ההכנה מושלכת, ועיכול חדש של חתיכות DSM מתבצע אך עם מרווחי דגירה מופחתים. אם ההליך גורם למעט מדי תאי DSM, אז עבור העיכול הבא של חתיכות DSM, מרווחי הדגירה גדלים. תגובתיות חיסונית חיובית לאקטין שריר α חלק מאשרת את זהותם של תאי DSM (איור 3).

סוג הפתרון	הרכב (ב mM)
DS (תמיסת דיסקציה/עיכול)	80 Na-גלוטמט, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 ו-11 גלוקוז, pH מותאם ל-7.4 (עם 10M NaOH)
DS-P (DS המכיל פפאין)	DS המכיל 1-2 מ"ג/מ"ל פפאין, 1 מ"ג/מ"ל דיתיותרייטול ואלבומין בסרום בקר 1 מ"ג/מ"ל
DS-C (DS המכיל Collagenase)	תמיסת DS המכילה 1-2 מ"ג/מ"ל קולגנאז סוג II, אלבומין בסרום בקר 1 מ"ג/מ"ל, מעכב טריפסין 0 או 1 מ"ג/מ"ל ו-100-200 מיקרומטר Ca2+
P (פיפטה)	110 CsOH, 110 חומצה אספרטית, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0.05 EGTA ו-30 CsCl, pH מותאם ל-7.2 עם CsOH, ובתוספת אמפוטריצין-B (300-500 מיקרוגרם/מ"ל)
E (חוץ-תאי)	10 טטראתילמוניום כלוריד (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES ו-10 גלוקוז, pH מותאם ל-7.3-7.4 עם NaOH או CsOH, ו-0.002-3 (2-3 מילימול) ניפדיפין

טבלה 1: הרכבי תמיסת דיסקציה/עיכול (DS), ותמיסות פיפטה ותמיסות חוץ-תאיות המשמשות בניסויי מהדק טלאי מחורר.

תוצאות

איור 1: סיכום שלבי דיסקציה שתוצאתם הכנת חלקי שריר חלק (DSM) והתקנה המשמשים לדיסוציאציה אנזימטית. מוצגות תמונות של: (A) דגימה של שלפוחית השתן האנושית בעובי מלא שסופקה מניתוח שלפוחית שתן פתוחה כחומר כירורגי חיצוני ב-DS קר כקרח, (B) אותו תכשיר לאחר הצמדה לשכבת DSM מנותחת חלקית, (C) חתיכות DSM בממדים משתנים שנחתכו משכבת ה-DSM ומוכנות לעי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול	בז	352054	צינורות עבור DS המכילים אנזימים המשמשים בשלבי העיכול
מערבל מערבולת אנלוגי	VWR	58816-121
אלבומין בסרום בקר	סיגמא-אולדריץ'	A7906	ד"ש
סידן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	C1016	פתרון חוץ-תאי ו-DS
EGTA	סיגמא-אולדריץ'	E3889	Ca2+ chelator, המשמש בתמיסת פיפטה תוך תאית
גלוקוז	סיגמא	G8270
קולגנאז סוג 2	תאגיד הביוכימיה וורת'ינגטון	LS004177	DS-C
צזיום הידרוקסיד הידרט	סיגמא-אולדריץ'	C8518	תמיסת פיפטה תוך תאית
CsCl	סיגמא-אולדריץ'	203025	פתרונות חוץ-תאיים ותוך-תאיים
DL-Dithiothreitol (DDT)	סיגמא-אולדריץ'	D9779	חומרים מפחיתים בשימוש יחד עם פפאין
נאוה	סיגמא-אולדריץ'	S8045
ניפדיפין	סיגמא-אולדריץ'	N7634	חוסם ערוצים Ca2+ מגודר מתח מסוג L
מתלה/מחזיק צינור קצף צף	VWR סיינטיפיק	82017-634	משמש להחזקת צינורות עם אנזימים לבקרת טמפרטורה
חומצה גלוטמית (מלח Na)	סיגמא-אולדריץ'	G1626	ד"ש
פפאין	תאגיד הביוכימיה וורת'ינגטון	LS003126	DS-P
MgCl2 (הקסהידראט)	סיגמא-אולדריץ'	M2670	פתרונות חוץ-תאיים ותוך-תאיים
KCl	פישר סיינטיפיק	BP366-1	פתרון חוץ-תאי
NaCl	סיגמא-אולדריץ'	S7653	פתרונות חוץ-תאיים ותוך-תאיים
מחט מזרק לא מתכתית, MicroFil	WPI	MF-34G-5	מילוי תמיסת פיפטה תוך תאית
פיפטה פסטר	פישרברנד	13-678-20א	הקצוות מפורקים ומלוטשים באש ומשמשים לטיטרציה של רקמות שטופלו אנזימטית כדי לשחרר תאי DSM בודדים מחתיכות
HEPES	סיגמא-אולדריץ'	H3375	מאגר pH
אמבט מים מטלטל Thermo Scientific Precision (דגם 2870)	תרמו סיינטיפיק	הופסק	אמבט מים לבקרת טמפרטורה של עיכול אנזימטי המשמש כחלופה למערך אמבטיה במחזור תאי רקמות
צינורות ויניל	קולפאלמר	06405-3	שימושים מרובים כולל לחיבור אמבט רקמות לאמבט מים במחזור
אמבט מחזור מים, Haake D1 L	האקה	הופסק	מחובר לאמבט רקמות
ZeissAxiovert 40C מיקרוסקופ הפוך עם מטרות פי 10 ו-40	קרל-זיס	הופסק	חלק מהגדרת מתקן מהדק טלאי