Amphotericin-B מתווך תיקון מהדק תיקון: טכניקה אלקטרופיזיולוגית לחקר זרמים יוניים בתאי שלפוחית השתן

Abstract

מקור: Malysz, J. et al. הכנה וניצול של תאי שריר חלק אנושיים שבודדו זה עתה לאפיון זרמי קטיון רגישים 9-פננתרול. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים אפיון של זרמים קטיוניים מתעלות יונים מסוג 4 (TRPM4) של קולטן חולף בתאי שריר חלק באמצעות אמפוטריצין-B בטכניקת מהדק טלאי מחורר בתיווך. הטכניקה מסייעת להעריך את התכונות הביופיזיקליות והפרמקולוגיות של תעלות יונים.

Protocol

1. הקלטת זרמי קטיון המושרים על ידי מדרגת מתח מתאי DSM באמצעות טכניקת תיקון מתח תא שלם מחורר Amphotericin-B

1. פיפטה 0.25-1 מ"ל של תרחיף תאים על תא תחתית זכוכית יושב על במה של מיקרוסקופ הפוך ומאפשר לתאים להיצמד לתחתית הזכוכית.
2. לאחר הדגירה של 45 דקות לפחות, יש להסיר את תמיסת העיכול (DS) מהאמבטיה ולהחליף בתמיסת E (טבלה 1) באיחוי כאשר זרימת התמיסה בעזרת כוח הכבידה באמצעות צינורות כניסה מחליפה באיטיות את DS בתמיסה החדשה, בעוד צינורות יציאה המחוברים לכלי פסולת ואקום מסירים את תמיסת התא ומונעים הצפה.
   הערה: תמיסת E מכילה יוני טטראתילמוניום (^TEA+) וצזיום (Cs⁺) לעיכוב זרמי K⁺.
3. הכן תמיסת מלאי עבודה של amphotericin-B ב dimethyl sulfoxide (DMSO) (1 מ"ג לכל 10 μL של DMSO). כדי להמיס לחלוטין אבקת אמפוטריצין, סוניקציה (לפחות 15 דקות) ולערבל את התמיסה היטב.
   הערה: שלב זה אורך בדרך כלל פחות מ-10 דקות. המסת 3-4 מ"ג של אמפוטריצין-B ב-30-40 מיקרוליטר של DSMO בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל עובדת היטב. כמויות גבוהות יותר של אמפוטריצין-B דורשות יותר ממס DSMO בדרך כלל וכתוצאה מכך מרווח זמן ארוך יותר לערבוב ומסיסות חלקית של חלקיקי מוצק אמפוטריצין-B הנמצאים בצינור.
4. יש להמיס תמיסת מלאי של אמפוטריצין-B בתמיסת פיפטה (תמיסה P, טבלה 1) לקבלת ריכוז סופי של 200-500 מיקרוגרם/מ"ל. שלב זה דורש סוניקציה נרחבת ומערבולות במהירות גבוהה (8-10/10) במשך ~30 עד 60 דקות לכל צעד כדי להבטיח ערבוב אופטימלי ומניעה של היווצרות משקעים אמפוטריצין-B בתמיסת פיפטה.
   הערה: אמפוטריצין-B יזרז עם הזמן והוא רגיש לאור. תמיסת פיפטה עובדת המכילה Amphotericin-B נבדקת למסיסות, מעורבבת ידנית לפני מילוי פיפטה, ונשמרת בחושך.
5. משכו אלקטרודות טלאי מרובות, קצוות אלקטרודות ללק אש, ובמידת הצורך צפו את הקצוות בשעווה דנטלית.
6. מלא את קצה אלקטרודת המדבקה בתמיסת פיפטה (תמיסה P, טבלה 1) ללא אמפוטריצין-B על ידי טבילה קצרה של האלקטרודה בתמיסה.
7. מלאו את האלקטרודה באותה תמיסת פיפטה המכילה אמפוטריצין-B.
8. הרכיבו את האלקטרודה על מחזיק המחובר לראש מגבר מהדק טלאי.
9. באמצעות מיקרומניפולטור, מקם את האלקטרודה ממש מתחת לפני השטח של התמיסה החוץ תאית כך שקצה האלקטרודה פשוט שקוע.
10. במצב מהדק מתח, הגדר את פוטנציאל ההחזקה ל- 0 mV וכוונן את הזרם ל- 0 pA באמצעות חוגת היסט פיפטה במגבר המסחרי (Table of Materials).
11. קבע את התנגדות האלקטרודות באמצעות חלון בדיקת הממברנה/הפונקציה של תוכנת הרכישה המסחרית (Table of Materials). כדי להפעיל, לחץ על Tools>Membrane Test>Play או על סמל קיצור דרך בתוכנה. התנגדות האלקטרודה שנקבעה צריכה להיות בטווח של 2 עד 5 MΩ.
    הערה: ניתן להשתמש בפונקציית בדיקת ממברנות המסופקת בתוכנת הרכישה המסחרית או באפשרות בדיקת האטימה במגבר כדי לנטר את התנגדות האלקטרודה על ידי הפעלת מדרגות מתח באופן חוזר.
12. המשיכו לעקוב אחר התנגדות האלקטרודות תוך כדי קידום האלקטרודה לעבר תא DSM נבחר בעזרת מיקרומניפולטור (איור 1A).
    הערה: כדי להיחשב לתא DSM בר קיימא, התא חייב להראות מורפולוגיה מוארכת בצורת ציר, הילה מוגדרת היטב סביב התא, קצוות חדים ומראה חצי מתכווץ (סרפנטין).
13. כאשר נוגעים במשטח התא עם האלקטרודה – המסומנת על ידי עלייה מהירה בהתנגדות האלקטרודה הנמדדת באמצעות פונקציית בדיקת הממברנה – יוצרים חותם ג'יגה על ידי הפעלת לחץ שלילי מהיר עדין על מחזיק האלקטרודה באמצעות צינור. התוצאה היא לחץ שלילי שנוצר בקצה האלקטרודה שמושך את קרום התא לתוך האלקטרודה, מה שמסייע להיווצרות חותם ג'יגה, או מגע הדוק מאוד בין האלקטרודה לקרום הפלזמה (איור 1B).
14. ברגע שחותם הג'יגה נוצר, פצה על קיבול פיפטה על ידי התאמת חוגות מהירות ואיטיות, במגבר המסחרי ונטר יציבות ג'יגה-אטם (זרם דליפה) באמצעות פונקציית בדיקת הממברנה.
15. תנו זמן, בדרך כלל 30-60 דקות, לאמפוטריצין-B להתפזר במורד פיפטה ולהיות מוכנס לתוך קרום הפלזמה וליצור נקבוביות סלקטיביות בעיקר לקטיון חד-ערכי. במהלך שלב זה, המשך לעקוב אחר חותם הג'יגה עם פונקציית בדיקת הממברנה. ככל שניקוב התא גדל, כך גדלה המשרעת של מעברי הקיבול (השוו את איור 1B לעומת איור 1C המציג ניקוב תאים ללא ניקוב יעיל, בהתאמה) שנמדדה באמצעות פונקציית בדיקת הממברנה.
16. כאשר ניקוב התיקון הוא אופטימלי (נשפט על פי התנגדות סדרה יציבה בדרך כלל מתחת ל- 50 MΩ), בטל את מעברי הקיבול על ידי התאמת החוגות לקיבול התא והתנגדות הסדרה במגבר. פיצוי התנגדות סדרתי יכול להתבצע גם בשלב זה (איור 1D).
17. לאחר שנצפו זרמי קטיון המושרים על ידי שלב מתח יציב המתעוררים על ידי הפרוטוקול שצוין, יש להחיל תרכובת או מצב פיזיולוגי לבדיקה על ידי עירוי ולתעד את התגובות לשליטה, למצב הבדיקה ולשטיפה (במידת האפשר) באמצעות תוכנת הרכישה המסחרית.
    1. הקלט זרמים באמצעות פרוטוקול מתח שלב שגרתי הכולל החזקת תאי DSM ב -64 או -74 mV והגברת המתח במרווחים של 10 mV במשך 400 או 500 מילישניות מ -94 ל +96 או +106 mV וחזרה לפוטנציאל ההחזקה.
       הערה: ערכי פוטנציאל הממברנה מותאמים לפוטנציאל צומת נוזלי של 14 mV (באמצעות פתרונות P ו- E, טבלה 1). פוטנציאל הצומת הנוזלי מתקבל בתוכנת הרכישה המסחרית (Table of Materials) על ידי לחיצה על Tools>Junction Potentials והזנת ריכוזי רכיבי יוני התמיסה. פרוטוקול רמפה יכול לשמש גם כדי להשיג הקלטות נוכחיות.
    2. הפעל את פרוטוקול המתח במרווח רציף ~ 1 דקות במהלך ניסוי הקלטת זרמים לבקרת טרום חיבור, מצב הבדיקה ושטיפה

סוג הפתרון	הרכב (ב mM)
DS (דיסקציה/תמיסת עיכול)	80 Na-גלוטמט, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 ו-11 גלוקוז, pH מותאם ל-7.4 (עם 10M NaOH)
DS-P (DS המכיל פפאין)	DS המכיל 1-2 מ"ג/מ"ל פפאין, 1 מ"ג/מ"ל דיתיותרייטול ו-1 מ"ג/מ"ל אלבומין בסרום בקר
DS-C (DS המכיל Collagenase)	תמיסת DS המכילה 1-2 מ"ג/מ"ל קולגנאז סוג II, אלבומין בסרום בקר במינון 1 מ"ג/מ"ל, מעכב טריפסין 0 או 1 מ"ג/מ"ל ו-100-200 מיקרומטר Ca2+
P (פיפטה)	110 CsOH, 110 חומצה אספרטית, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0.05 EGTA ו-30 CsCl, pH מותאם ל-7.2 עם CsOH, בתוספת אמפוטריצין-B (300-500 מיקרוגרם/מ"ל)
E (חוץ-תאי)	10 טטראתילמוניום כלוריד (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES ו-10 גלוקוז, pH מותאם ל-7.3-7.4 עם NaOH או CsOH, ו-0.002-3 (2-3 מילימטר) ניפדיפין

טבלה 1: הרכבי תמיסת דיסקציה/עיכול (DS), ותמיסות פיפטה ותמיסות חוץ-תאיות המשמשות בניסויי מהדק טלאי מחורר.

Results

איור 1: המחשה סכמטית של שלבים המעורבים ביצירת חותם ג'יגה וניקוב אמפוטריצין-B של תאי DSM אנושיים. מודגמים מיקומים מרחביים של אמפוטריצין-B המכיל פיפטה ותא DSM יחד עם תגובות נלוות לבדיקות ממברנה המתקבלות בתוכנת הרכישה המסחרית (Table of Materials) על ידי שינוי מדרגות מתח (-10 או -20 mV בדוגמה זו) הקובעות התנגדות. התצורות הן: (A) לפני התקרבות התא עם אלקטר...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול	בז	352054	צינורות עבור DS המכילים אנזימים המשמשים בשלבי העיכול
אמפוטריצין-B	פישר	BP928-250	משמש לניקוב טלאי/תא
אמפוטריצין-B	תקני ייחוס פרמקופיאה אירופיים	5	משמש לניקוב טלאי/תא
אמפוטריצין-B	סיגמא-אולדריץ'	A9528-100 מ"ג	משמש לניקוב טלאי/תא
מערבל מערבולת אנלוגי	VWR	58816-121
חומצה אספרטית	סיגמא-אולדריץ'	A9006	תמיסת פיפטה תוך תאית
אלבומין בסרום בקר	סיגמא-אולדריץ'	A7906	ד"ש
CaCl2	סיגמא-אולדריץ'	C1016	פתרון חוץ-תאי ו-DS
זכוכית נימית	סאטר	BF150-110-7.5	נימי להכנת אלקטרודות טלאי שנמשכו
צזיום הידרוקסיד הידרט	סיגמא-אולדריץ'	C8518	תמיסת פיפטה תוך תאית
תוכנת Clampex ver. 10 כוללת תוכנות Data Acqusition (Clampex) וניתוח (Clampfit)	Axon Instruments/ התקנים מולקולריים	pCLAMP-10	תוכנה מסחרית וחלק מהתקנת מתקן מהדק תיקון
CsCl	סיגמא-אולדריץ'	203025	פתרונות חוץ-תאיים ותוך-תאיים
שעווה דנטלית	Miltex שיניים שעווה טכנולוגיות, Inc.	18058351
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	סיגמא-אולדריץ'	D2650	הממס
EGTA	סיגמא-אולדריץ'	E3889	Ca2+ chelator, המשמש בתמיסת פיפטה תוך תאית
מושך מיקרופיפטה בוער/חום	סאטר	P-97	נדרש למשוך אלקטרודות עם קצוות עדינים מאוד
מתלה/מחזיק צינור קצף צף	VWR סיינטיפיק	82017-634	משמש להחזקת צינורות עם אנזימים לבקרת טמפרטורה
גלוקוז	סיגמא	G8270
חומצה גלוטמית (מלח Na)	סיגמא-אולדריץ'	G1626	ד"ש
HEPES	סיגמא-אולדריץ'	H3375	מאגר pH
KCl	פישר סיינטיפיק	BP366-1	פתרון חוץ-תאי
מערכת קליטת נתונים עם רעש נמוך	Axon Instruments/ התקנים מולקולריים	Digidata 1440A	חלק מהגדרת מתקן מהדק טלאי
מערבל מגנטי	VWR	01-442-684
MgCl2 (הקסהידראט)	סיגמא-אולדריץ'	M2670	פתרונות חוץ-תאיים ותוך-תאיים
מיקרופורג'	נארישיגה	MF-830	משמש לאלקטרודות ליטוש אש
NaCl	סיגמא-אולדריץ'	S7653	פתרונות חוץ-תאיים ותוך-תאיים
נאוה	סיגמא-אולדריץ'	S8045
ניפדיפין	סיגמא-אולדריץ'	N7634	חוסם ערוצים Ca2+ מגודר מתח מסוג L
מיקרוסקופ הפוך של Nikon, TS100 עם שלב T1-SM עם מטרות 5x, 10x, 20x ו-40x	ניקון	הופסק	חלק מהגדרת מתקן מהדק תיקון
מחט מזרק לא מתכתית, MicroFil	WPI	MF-34G-5	מילוי תמיסת פיפטה תוך תאית
פיפטה פסטר	פישרברנד	13-678-20א	הקצוות מפורקים ומלוטשים באש ומשמשים לטיטרציה של רקמות שטופלו אנזימטית כדי לשחרר תאי DSM בודדים מחתיכות
מגבר מהדק טלאי	Axon Instruments/ התקנים מולקולריים	אקסון Axopatch 200B	חלק מהגדרת מתקן מהדק טלאי
מחשב PC	DELL	תצורה מותאמת אישית	חלק מהגדרת מתקן מהדק טלאי
מד pH	אספרה אינסטרומנטס	PH700
צינורות פוליאתילן	אינטרמדיק	427-436	צינורות לעירוי של אמבטיה חוץ-תאית המחוברת לתא הקלטה בתחתית זכוכית
טטראתילמוניום כלוריד	סיגמא-אולדריץ'	T2265	חוסם תעלות יונים של תעלות Kv ו- BK נוסף לפתרון האמבטיה החוץ תאית
סולם שקלול	מטלר טולדו	XS64
ZeissAxiovert 40C מיקרוסקופ הפוך עם מטרות פי 10 ו-40	קרל-זיס	הופסק	חלק מהגדרת מתקן מהדק טלאי