כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
הערה: עכברי בר בריאים (WT) לא מטופלים (n = 4) ועכברי cd44-/- (n = 4) הוקרבו בגיל 12-16 שבועות. נעשה שימוש הן בעכברים זכרים והן בנקבות. כל העכברים היו על רקע C57Bl/6.
1. דיסקציה של כליות עכבר
- להקריב עכברי WT בריאים או עכברים שעברו שינוי גנטי על ידי נקע צוואר הרחם.
- נתחו כליות עכבר שלמות מיד לאחר הקרבת העכברים. לשם כך, לבצע laparotomy החציוני באמצעות מספריים הבטן, חיתוך העור ולאחר מכן את שרירי הבטן. הסר את המעי והנח אותו ליד העכבר.
- שחררו את הכליות מחיבור רקמות ושלפו את הכליה באמצעות מלקחיים כירורגיים, חתכו את עורק הכליה, וריד הכליה והשופכן במספריים.
- הסר את כמוסות הכליה מן הכליות על ידי החזקת הכליה עם מלקחיים כירורגיים למשוך את הקפסולה באמצעות זוג אחר של מלקחיים.
- מניחים את הכליות בצלחת תרבית תאים בת 6 בארות (2 כליות/באר) מוכנה עם 2 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) לכל באר ומניחים על קרח.
2. בידוד גלומרולי מכליה עכבר
- מעבירים את הכליות לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ וטוחנים את הכליות לחתיכות קטנות של 1-2 מ"מ באמצעות שני אזמלים. שמור על חתיכות הכליה הטחונות רטובות באמצעות 1-2 מ"ל של HBSS.
- מניחים את חתיכות הכליה הטחונות על גבי מסננת מתכת של 300 מיקרומטר ולוחצים את הכליה דרך המסננת באמצעות בוכנה של מזרק 20 מ"ל. שטפו שוב ושוב את המסננת עם HBSS בין לבין ואספו את הזרימה בצלחת פטרי נקייה באמצעות פיפטה סרולוגית. אספו גם את כל מה שנשאר/נדבק לצד התחתון של המסננת על ידי גירוד עם האזמל והעבירו אותו לזרם שנאסף (הומוגנט כליות).
- יש לשטוף את הכליה דרך מסננת של 75 מיקרומטר עם HBSS. אספו את הזרימה ולאחר מכן שטפו אותה דרך מסננת של 53 מיקרומטר. שטפו את שתי המסננות באמצעות HBSS כדי להסיר את כל המבנים הקטנים יותר.
הערה: בשלב זה, הזרימה נשטפת רק אך לא נלחצת דרך מסננת 75 מיקרומטר ו-53 מיקרומטר. שטיפה עם HBSS יש צורך להסיר פסולת ומבנים קטנים יותר על המסננות. לכן, בדרך כלל 200-300 מ"ל של HBSS משמשים בסך הכל.
- אספו את מבני הכליות / החומר שנותרו על המסננת של 75 מיקרומטר ו- 53 מיקרומטר על ידי שטיפת פני השטח העליונים של המסננות עם מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM) בתוספת 20% סרום עגל עוברי (FCS) והעבירו את החומר למיקרופלטית חיבור 6 בארות נמוכה במיוחד.
הערה: כדי לשטוף את המשטח העליון של המסננת, שטפו את המסננת במצב מוטה (>45°) ואספו את חומר הכליות בקצה המסננת. החומר שנאסף מועשר עבור גלומרולי עטוף כמו גם ערוף, מראה רק כמה שברים צינוריים. גלומרולי עטוף הם דביקים מאוד. כדי לאסוף גלומרולי בודד, לכן חשוב למנוע מגלומרולי להידבק לפני השטח של צלחת פטרי או צלחת באר. כדי למנוע היצמדות, השתמש בינוני עם 20% FCS והשתמש בלוחות חיבור נמוכים במיוחד לשלב זה.
3. טיפוח הצמיחה הגלומרולרית
- הביאו את המיקרו-צלחת בעלת החיבור הנמוך במיוחד למיקרוסקופ אור הפוך ואספו גלומרולי יחיד עטוף ו/או מכוסה עם פיפטה של 20 מיקרוליטר. הימנעו מצנרת של מבנים אחרים ופסולת. לאחר איסוף גלומרולוס יחיד בקצה פיפטה, להוסיף מדיום DMEM טרי ללא חומר כליות שנאסף לתוך אותו קצה פיפטה לנפח של 20 μL.
- מעבירים את הגלומרולוס היחיד עם תווך DMEM של 20 μL למרכז באר של צלחת תרבית תאים של 24 בארות ודגרים במשך 3 שעות ב 37 ° C ו 5% (v/v) CO2 כדי לאפשר חיבור של glomerulus למרכז הבאר. בזהירות להזיז את הצלחת כדי למנוע ציפה של glomerulus לגבולות הבאר.
- לאחר דגירה של 3 שעות, הגלומרולוס מחובר למרכז הבאר. יש להוסיף בזהירות 500 μL של מדיום בסיסי אנדותל (EBM) בתוספת ערכת גורם גדילה המכילה הידרוקורטיזון, גורם גדילה אנדותל אנושי, תמצית מוח בקר, וגנטמיצין סולפט-אמפוטריצין B (טבלה של חומרים) ועוד 5% (v/v) FBS ו-1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין (עט/סטרפ) לכל באר.
- תרבית את glomeruli יחיד במשך 6 ימים ב 37 ° C, 5% (v/v) CO2.
הערה: בתוך 6 ימים, הצמיחה המורכבת מתאי אפיתל קודקודיים נוצרים. אם שואפים לבדוק את ההשפעות של תרכובות או תרופות ספציפיות על תאי האפיתל הקודקודיים, יש להוסיף אותו למדיום בתוך תקופה זו של 6 ימים.
