$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. השתלת הגידול
הערה: כל עכבר מושתל עם 1 x 105 MB49-PSA תאים ב 50 μL של מדיה ריקה DMEM בשלפוחית השתן. בשל החלל המת בצנתר, תמיד להכין נפח נוסף (לפחות 100 μL נוסף לכל עכבר). גישה חלופית תהיה להשתמש מזרק מלא אוויר.
- תאים
- יום אחד לפני ההשתלה, כאשר התאים נמצאים בערך 80% בהתמזגות, עוברים את תאי הגידול MB49-PSA במדיית DMEM מלאה (בתוספת 10% FBS, 2 mmol / L L-גלוטמין, 0.05 מ"ג / מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין, ו 200 מיקרוגרם / מ"ל היגרומיצין B) ב 37 ° C ו 5% CO2 ביחס פיצול של 1: 2.
- ביום ההליך, קצרו את התאים על ידי גירודם בעדינות עם מגרד תאים סטרילי. ערבבו נפחים שווים של תרחיף התא ותמיסת טריפאן כחולה של 0.4%. ספור את התאים החיים באמצעות המוציטומטר. אין להשתיל אם יותר מ-20% מהתאים מתים.
- חשב את מספר התאים החיים הדרושים (2 x 106 תאים / מ"ל) והעבר אותם לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשליך את supernatant. השהה מחדש את גלולת התא במדיה ריקה של DMEM. חזור על הכביסה שלוש פעמים כדי להסיר את כל עקבות FBS לפני ההשתלה.
- שמור את תרחיף התא על קרח עד שהעכברים מוכנים להשתלה.
- אפשרו לנקבת עכברי C57BL/6J בת 4 עד 6 שבועות להתאקלם במשך שבוע לפני ההליך. כל עבודת בעלי חיים חייבת להתבצע בארון בטיחות ביולוגי כדי לשמור על תנאים סטריליים.
- יש לשקול כל עכבר ולהזריק חומר הרדמה (75 מ"ג/ק"ג קטמין ו-1 מ"ג/ק"ג מדטומידין) תוך צפקית ב-0.1 מ"ל לכל 10 גרם משקל גוף. משקל הגוף צריך להיות בין 17 ל 22 גרם. אשר את ההרדמה על ידי התבוננות בחוסר תגובה לאחר צביטת בוהן.
- לצורך זיהוי, סמן את האוזן באמצעות ניקוב באוזן.
- הזריקו את התמיסה או התרכובת של הרטמן נתרן לקטט תוך צפקית ב 0.1 מ"ל לכל 10 גרם של משקל גוף כל 1-2 שעות עבור הידרציה.
- החל משחה אופתלמית סטרילית על שתי העיניים באמצעות נורת כותנה סטרילית, שכן רפלקס המצמוץ אובד תחת הרדמה והעיניים מתייבשות. יש למרוח שוב בעת הצורך.
- הניחו את העכברים במצב שכיבה על מגבות נייר על גבי חבילת חום (המופעלת על ידי מגע עם אוויר) כדי לשמור על טמפרטורת הגוף והדביקו את הרגליים האחוריות כלפי מטה.
- בעזרת אצבע, הפעילו לחץ עדין על אזור הבטן התחתונה ואספו שתן משלפוחית השתן לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. דגימה זו משמשת כערך הבסיסי של PSA בשתן.
- משוך פולי-L-ליזין סטרילי (PLL) לתוך מזרק 1 מ"ל וחבר קטטר IV 24 מד, עם המחט stylet הוסר. יש למרוח חומר סיכה על קצה הצנתר ולהחדיר את הצנתר דרך השופכה לשלפוחית השתן באמצעות מלקחיים כדי להנחות את הצנתור. עצור כאשר ההתנגדות מורגשת.
הערה: החוקרים צריכים לדון עם הצוות הווטרינרי שלהם על הצורך בשימוש בג'ל סיכה עם הרדמה להחדרה תוך שלפוחית ושימוש במשככי כאבים לאחר ההליך.
- להחדיר 50 μL של PLL לאט, בקצב של 10 μL כל 20 שניות, כדי למנוע ריפלוקס שלפוחיתי. השאירו את הצנתר בשלפוחית השתן למשך 20 דקות עם פקק כדי למנוע זרימה החוצה.
- לאחר 20 דקות, הוציאו את הצנתר ופנו את שלפוחית השתן מכל תוכן על ידי לחיצה עדינה על אזור הבטן התחתונה. בעזרת מזרק ריק בנפח 1 מ"ל, יש לשטוף את כל התכולה שנותרה מתוך הצנתר.
- מערבבים היטב תאי MB49-PSA על ידי פיפטציה ומושכים אותם לתוך מזרק 1 מ"ל. חברו את הצנתר ומרחו חומר סיכה. להחדיר 50 μL של 1 x 105 תאים בקצב איטי של 10 μL כל 20 שניות. החלף את הפקק בצנתר. תן עכברי ביקורת 50 μL של מלוחים.
- לאחר שעה אחת, הסר את הצנתרים ופנה את שלפוחית השתן מכל תוכן. הסר את הסרט על הרגליים האחוריות והנח את העכברים על צידי הגחון שלהם. להחיות את העכברים על ידי הזרקה תת עורית של תרופת ההיפוך (1 מ"ג / ק"ג atipamezole) ב 0.1 מ"ל לכל 10 גרם של משקל גוף.
- עקוב אחר העכברים עד שנצפתה תנועתיות. החזירו את העכברים לכלוביהם.