העברת פלסמידים של DNA לתוך אורותל של שלפוחית השתן של עכבר: הליך מבוסס אלקטרופורציה כדי להעביר ביעילות פלסמידים DNA לתוך תאי השתן של שלפוחית השתן כדי ליצור מודלים מהונדסים גנטית

תקציר

מקור: Chuan, Y. et al. שיטה חדשנית להעברת DNA פלסמיד לאורוטליום שלפוחית השתן של עכבר באמצעות אלקטרופורציה. J. Vis. Exp.(2018)

סרטון זה מדגים את העברת פלסמיד DNA לתוך השתן של שלפוחית השתן של העכבר באמצעות שילוב של טכניקות צנתור שופכה ואלקטרופורציה. ההליך המתואר מאפשר יצירת מודלים של סרטן שלפוחית השתן של עכבר.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. פלסמיד והכנת כלים

1. כדי שכל שלפוחית השתן תוכל להתחלף, הכינו לפחות 20 מיקרוליטר של פלסמיד DNA (1 מיקרוגרם/מיקרוליטר).
2. הוסף 1 μL של Trypan Blue ל 20 μL של תמיסת פלסמיד בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. פיפטה לערבב היטב.
3. Autoclave כל כלי הניתוח לעקר את סביבת העבודה עם 70% אתנול. רססו כלי ניתוח וכפפות עם אתנול 70% לעתים קרובות או השתמשו במעקר חרוזי זכוכית בעת ביצוע השלבים הבאים לשמירה על תנאים סטריליים.

2. משלוח פלסמיד

1. החל 70% אתנול על בטן העכבר המרדים והשתמש באזמל כדי לבצע חתך אנכי של 1 ס"מ כדי לפתוח את עור הבטן מעל שלפוחית השתן.
2. פיפטה לפחות 20 μL של פלסמיד בתוספת תמיסת Trypan Blue לקצה החיצוני של הצנתר ולחבר את המזרק.
3. הזריקו את תמיסת הפלסמיד לשלפוחית השתן. אם שלפוחית השתן הופכת כחולה, ההזרקה מצליחה. השאירו מעט נוזלים בצנתר כדי למנוע יצירת בועות אוויר בשלפוחית השתן.
4. תפוס את פתח השופכה החיצוני באמצעות פינצטה ולאחר מכן להסיר את הקטטר ואת המזרק. השתמש בחוט כדי להדק את פתח השופכה החיצוני. צור שתי לולאות עם החוט ולאחר מכן קשור עם שני קשרים.
   הערה: הידוק השופכה חשוב למניעת זרימה חוזרת של נוזל פלסמיד.
5. הפעל את מחולל האלקטרופורציה עם הפרמטרים הבאים: 33V, זמן עבודה של 50 אלפיות השנייה וזמן מרווח של 950 אלפיות השנייה.
6. החזיקו את שלפוחית השתן בפינצטה וצבטו את שלפוחית השתן בשתי אלקטרודות. לחץ על דוושת הרגל כדי לבצע את electroporation.
   הערה: הפולסים החשמליים מכוונים להתרחש 5 פעמים עם מרווחים קצרים לאחר כל לחיצה על הדוושה. העכבר עלול להתעוות בתהליך זה. לחיצה על דוושת הרגל יותר מפעם אחת יכולה להגביר את יעילות ההעברה, אך יותר מדי פולסים חשמליים עלולים לפגוע בשלמות הרקמה של האורטל.
   1. הימנע מכל מגע בין פינצטה לבין אלקטרודות, כמו זה ייצור ניצוץ.

3. החלמה

1. תפרו את פתח הבטן והעור באמצעות תפרים וקליפסים כירורגיים סטריליים. יש למרוח יוד על הפצע.
2. הסר את החיה ממערכת isoflurane. מתן משכך כאבים buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג) תת עורית כדי להקל על כאב לאחר הניתוח.
3. השאירו את בעל החיים על כרית החימום והחזירו אותו לכלוב הביתי לאחר החלמה מלאה. בדוק את בעל החיים לפחות פעם ביום עבור ניידות נורמלית, שתייה, התנהגויות האכלה ואין סימנים של זיהום עד החתך נרפא, ולאחר מכן להסיר את קליפסים. לנהל זריקות הבאות של משכך כאבים buprenorphine אם החיה מציגה תסמיני כאב כגון טיפוח מופחת, תוקפנות מוגברת, וקול.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מזרק BD 1mL TB	פישר	148232E
בופרנורפין	סיגמא	B9,275-50MG
פינצטה Dumont	Roboz Surgical Instr	RS-5005	יש לטפל באתנול 70% לפני שימוש כירורגי
ECM830 SQ גל אלקטרופורטור	מכשיר הרווארד	450052
אקסל הבינלאומי בטוח חד פעמי I.V. צנתרים	פישר סיינטיפיק	14-841-21	24G, אורך 2.11 ס"מ, קוטר חיצוני 0.045 ס"מ
מספריים לניתוח מיקרו דק במיוחד	Roboz Surgical Instr	RS-5135	יש לטפל באתנול 70% לפני שימוש כירורגי
איזופלורן	וטרינר אחד	501017
K&H שטיח מנוחה מחומם לבעלי חיים קטנים, 9 על 12 אינץ '	אמזון		מכסים את שטיחון החימום במגבות נייר
משחת עיניים	פישר	NC0849514
PBS, pH 7.4	לייף טכנולוגיות	10010049
טיפים Pipet 200 μL	ארה"ב סיינטיפיק	1111-0206
Pipet Tips, התאמה אוניברסלית; 0.1 עד 10 μL	פישר	02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2	גילסון	F144561
PIPETMAN NEO P200N	גילסון	F144565
פלסמיד CAG-GFP	אדג'ין	16664
טוויטר פלטינום 5 מ"מ	מכשיר הרווארד	450489	קוטר 5 מ"מ
מספריים	Roboz Surgical Instr	RS-5880	יש לטפל באתנול 70% לפני שימוש כירורגי
חוט מחרוזת	אמזון		מנדלה מלאכת יד 150D 210D 0.8 מ"מ תפירת עור 1 מ"מ תפירה חוט שטוח שעווה חוט
קלטת, סקוטש	פישר	19047257
חומר סיכה וטרינרי Therio-gel	PBS בריאות בעלי חיים	353-736
טריפאן כתם כחול	לייף טכנולוגיות	15250061
V-1 הרדמת מערכת שולחנית	VetEquip	901806
תפר סגול Vicryl 18" FS-2 חיתוך 5-0	פישר	NC0578475
וולגרינס פובידון יוד 10%	וולגרינס	953982
קליפס לפצע	פישר	18045
קליפס פצע applier	פישר	1804