בידוד אקסוזום: טכניקת אולטרה-צנטריפוגה מבוססת צפיפות המשתמשת בכרית סוכרוז כדי להפריד אקסוזומים ממדיה מותנית של תאים בתרבית

תקציר

מקור: Faruqu, F. N. et al. הכנת אקסוזומים להעברת siRNA לתאים סרטניים.J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מתאר טכניקת אולטרה-צנטריפוגה מבוססת צפיפות לבידוד אקסוזומים ממדיה מותנית שנקטפה מתרביות תאי כליה עובריים אנושיים באמצעות כרית סוכרוז של 25% (w/w) שהוכנה בתחמוצת דאוטריום. האקסוזומים המבודדים יכולים לשמש ליישומים במורד הזרם.

פרוטוקול

1. בידוד אקסוזום על כרית סוכרוז

1. נקה מראש את המדיה המותנית שנקטפה (CM) על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית וסינון כדלקמן.
   1. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להעביר את supernatant לתוך צינור חדש ולהשליך את הכדור. חזור על שלב הצנטריפוגה פעם נוספת, מחלץ את הסופרנאטנט ומשליך את הכדור.
   2. צנטריפוגה את הסופרנאטנט משלב 1.1 בטמפרטורה של 2,000 x גרם למשך 15 דקות ו-4°C ולאחר מכן השליכו את הכדור. סננו את הסופרנאטנט המשוחזר פעם אחת דרך מסנני 0.22 מיקרומטר.
2. במהלך הניקוי המוקדם, הכינו תמיסת סוכרוז של 25% (w/w) בתחמוצת דאוטריום על ידי שקילה מדויקת של 1.9 גרם (± 0.001 גרם) של סוכרוז בצינור אוניברסלי, ולאחר מכן מילוי עם תחמוצת דאוטריום עד שהמשקל מגיע ל -7.6 גרם (± 0.001 גרם).
3. מלא צינור אולטרה-צנטריפוגה (ראה טבלת חומרים) ב-22.5 מ"ל של CM מנוקה מראש. פצה את ה-CM ל-22.5 מ"ל עם PBS מסונן של 0.22 מיקרומטר אם הנפח הנוכחי קטן מזה.
4. מניחים פיפטה מזכוכית (ראו טבלת חומרים) בצינור ודרכו מוסיפים 3 מ"ל של תמיסת סוכרוז כך שהתמיסה יוצרת שכבה נפרדת מתחת לס"מ.
5. הניחו בזהירות את הצינור המכיל שכבות CM/תמיסת סוכרוז לתוך דלי של רוטור מתנדנד החוצה (ראו טבלת חומרים) והדקו את הדלי לתוך הרוטור.
6. הכניסו את הרוטור לאולטרה-צנטריפוגה (ראו טבלת חומרים) וסובבו ב-100,000 x גרם במשך 1.5 שעות ב-4°C.
7. אספו 2 מ"ל משכבת הסוכרוז והוסיפו זאת לבקבוק אולטרה-צנטריפוגה (ראו טבלת חומרים) המכיל 20 מ"ל PBS מסונן לשלב שטיפה.
8. הכנס את הצינורות לרוטור בעל זווית קבועה (ראה טבלת חומרים) וסובב במהירות של 100,000 x גרם במשך שעה וחצי ב-4°C.
9. בזהירות להסיר את supernatant עם פיפטה סרולוגית 10 מ"ל להשעות מחדש את הגלולה עם 400 μL מסונן PBS. שמור על מלאי exosome זה ב 4 ° C או -80 ° C לאחסון לטווח קצר ולטווח ארוך בהתאמה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סוכרוז	פישר סיינטיפיק	ש/8600/60	1 ק"ג
תחמוצת דאוטריום (D2O)	סיגמא-אולדריץ'	151882	250 גרם
1X פוספט מלח חוצץ	תרמו פישר סיינטיפיק	10010015	500 מ"ל
יחידת מסנן מזרק Millex-GP 0.22 מיקרומטר	מיליפור	SLGP033RS
אולטרה-צנטריפוגה	בקמן קולטר	אופטימה XPN-80
רוטור מתנדנד החוצה	בקמן קולטר	SW45 Ti
רוטור בזווית קבועה	בקמן קולטר	סוג 70 Ti
צינורות אולטרה-צנטריפוגות	בקמן קולטר	355631	פוליקרבונט. מילוי מקסימלי 32 מ"ל
בקבוקי אולטרה-צנטריפוגות	בקמן קולטר	355618	פוליקרבונט. מילוי מינימלי 16 מ"ל, מילוי מרבי 25 מ"ל
צנטריפוגה	אפנדורף	5810R
פיפטות זכוכית	פישר סיינטיפיק	1156-6963
25% עם כרית סוכרוז			הוסף 1.9 גרם (± 0.001 גרם) של סוכרוז בצינור אוניברסלי, ומלא D2O עד שהמשקל מגיע 7.6 גרם (± 0.001 גרם). זה עושה ~ 6ml של 25% w / w כרית סוכרוז.