אנקפסולציה של siRNA לתוך אקסוזומים באמצעות אלקטרופורציה: טכניקה מבוססת פולסים חשמליים לטעינת siRNA לתוך אקסוזומים

תקציר

מקור: Faruqu, F. N. et al. הכנת אקסוזומים להעברת siRNA לתאים סרטניים. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מתאר שיטה מבוססת אלקטרופורציה לעטוף siRNA לתוך אקסוזומים. לאחר מכן ניתן להשתמש באקסוזומים טעוני siRNA ליישומים טיפוליים.

פרוטוקול

1. אנקפסולציה siRNA לתוך אקסוזומים על ידי אלקטרופורציה

1. מצננים מראש את קוביית האלקטרופורציה (ראו טבלת חומרים) על קרח במשך 30 דקות לפני ההתחשמלות.
2. יש לערבב 7.0 מיקרוגרם אקסוזומים (32 מיקרוליטר ממלאי 7 x 10¹² p/mL ב-PBS) עם 0.33 מיקרוגרם siRNA (12 μL ממלאי 2 מיקרומטר במים נטולי RNase) בצינור המיקרוצנטריפוגה. לפצות את הנפח עד 150 μL עם חיץ חומצת לימון (ראה טבלה של חומרים). היחס המולרי בין exosome ל-siRNA הוא 1:60 במקרה זה.
3. מעבירים את התערובת לקובט אלקטרופורציה. מכסים את הקובטה ומניחים אותה במחזיק הקובטה של האלקטרופורטור (ראו טבלת חומרים). סובב את הגלגל המסתובב 180° בכיוון השעון.
   הערה: יש לסובב את הגלגל לחלוטין למצב נעול, על מנת שהקובטה תיצור קשר עם האלקטרודות.
4. בחר את תוכנית האלקטרופורציה הרצויה (למשל, X-01, X-05, A-20, T-20, T-30 וכו ') והתחל אלקטרופורציה על ידי לחיצה על לחצן ההפעלה.
   הערה: דופק מוצלח מסומן על ידי הצגת "אישור" על התצוגה.
5. לאחר התחשמלות, הסירו את הקובטה לאחר סיבוב הגלגל לאחור ב-180° נגד כיוון השעון. למשוך את הדגימה מן cuvette עם פיפטה פלסטיק לעיבוד נוסף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Atto655-siRNA	Eurogentec	כיכר סירנה	(מסומן-S) UGC-GCU-ACGAUC-GAC-GAU-G55; (ללא תוויתAS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAGCGC-A55.
פיפטות זכוכית	פישר סיינטיפיק	1156-6963
Amaxa Nucleofector I	לונזה	נוקלאופקטור I	עם ערכות Nucleofector של Amaxa
מאגר חומצת לימון עם EDTA			יש לערבב 0.1954 גרם חומצת לימון ו-0.2087 גרם דיסודיום פוספט ב-50 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה. הוסף EDTA ל- 0.1 mM. התאם את ה- pH ל- 4.4.
צינורות מיקרופוגה	סטארלאב	S1615-5500	1.5 מ"ל