כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. ביצוע ניתוח הזרקת אגן הכליה ההידרודינמי
- בחר עכברים בקפידה לניתוח.
הערה: הבדלים ספציפיים לזן עדיין לא נצפו אך עשויים להיות אפשריים. רוב הזריקות היו על רקע C57BL/6 או FVB. זריקות אגן הכליה פועלות בצורה הטובה ביותר בעכברים בני 6-12 שבועות. בעכברים מעל 16 שבועות, עד 50% שיעור כישלון על ידי הדמיה luciferase אפשרי מסיבות לא ברורות. אותו שיעור כשל הקשור לגיל נצפה עבור הזרקות הידרודינמיות של ורידי זנב לכבד, כך שזו עשויה להיות מגבלה כללית הקשורה לעקרון ההזרקה ההידרודינמית. באותו קו, אחרים הראו כי הזרקת וריד זנב הידרודינמי לכבד חולדה פיברוטית אינה יעילה כמו כבד בריא, כך שייתכן שבמצבים של פיברוזיס כלייתי ההזרקה ההידרודינמית של אגן הכליה לא תהיה יעילה באותה מידה, אך הדבר לא נבדק ישירות.
2. הכנת עכברים ומזרקי DNA לניתוח
- מרדימים את העכברים עם קטמין וקסילזין.
- לבשו את ציוד המגן האישי הנכון הנדרש על ידי מתקן בעלי החיים, כגון סינר מעבדה חד פעמי, מסכת פנים כירורגית וכפפות ניטריל.
- בעבודה עם 2-4 עכברים בו זמנית, שקלו כל עכבר בכד פלסטיק של 500 מ"ל בסולם מדויק ל-0.1 גרם. חשב את הכמות הנכונה של 24 מ"ג/מ"ל קטמין ו-2 מ"ג/מ"ל קסילזין מדולל במי מלח רגילים של 0.9% שיש לתת לכל עכבר בהזרקה תוך צפקית (ראה סרטון הפניה למידע נוסף על הזרקה תוך צפקית). יש להשתמש בפורמולה (50 μL + (5 μL) x (weight(g))), או לחילופין לחשב לפי נוסחה אחרת לאחר התייעצות עם הצוות הווטרינרי המקומי ועם IACUC.
- להזריק את העכבר על ידי הזרקה intraperitoneal על ידי טכניקות סטנדרטיות. הנח את העכבר בדלי נייר עד שהעכבר אינו נייד.
הערה: עכברים מוכנים לניתוח כאשר הם כבר לא מגיבים לבדיקת צביטת הבוהן. תן לעכברים שממשיכים להגיב לבדיקת צביטת הבוהן 20-30 דקות לאחר ההזרקה הראשונית 20-60 μL יותר הרדמה, בהתאם לעוצמת התגובה.
- הניחו את העכבר על כרית חום במחזור מים מכוסה בפד כחול והניחו משחה וטרינרית בשתי העיניים כדי למנוע התייבשות הקרנית.
- גלח את הצד השמאלי של גב העכבר מהכתף לעכוז ומאגף לעמוד השדרה עם מכונת גילוח המיועדת לטיפוח חיות מחמד. הסר שיער רפוי ולכלוך.
- הכינו מזרק נפרד המכיל 100 מיקרוליטר DNA מדולל לכל עכבר מורדם, וודאו שאין בועות אוויר.
- השתמש מזרק אינסולין סטרילי בגודל 29G x 1/2" 0.5 מ"ל U-100 עם מחט המחוברת באופן קבוע ללא בטיחות.
הערה: סוג המזרק הוא בעל חשיבות קריטית. מד זה מאפשר הזרקה מהירה. המחט המחוברת באופן קבוע מונעת מהתמיסה לדלוף החוצה. נוכחות הבטיחות תעכב את הגישה לאגן הכליה. המזרקים שצוינו בטבלת החומרים מחליקים באופן שווה יותר במהלך ההזרקה מאשר מותגים אחרים שנבדקו.
- טען את המזרק ל~ 120 μL ומשוך את הבוכנה למטה כדי ליצור רווח בחלק העליון. הקש עם עט עד שכל בועות האוויר יעלו למעלה. מחזיקים את המחט למעלה, בזהירות ללחוץ על הבוכנה כדי להסיר את כל האוויר עד שטיפה נוצרת בקצה המחט. לא אמורות להיות בועות נראות לעין, שכן אלה עלולות לגרום לתסחיף אוויר שיהרוג את החיה.
- סיים ללחוץ על הבוכנה עד שיש 100 μL במזרק על ידי ריקון תמיסת DNA עודפת לתוך צינור microfuge המקורי. יש לתייג בזהירות במידת הצורך ולהניח את המזרקים הטעונים על וילון סטרילי כדי לשמור על סטריליות אם המתקן שבו מתבצעת העבודה אינו מאפשר סתימת מחטים.
3. ביצוע ניתוח הזרקה
- הכינו את האתר לניתוח. הניחו וילון סטרילי מעל כרית החימום ורוקנו כלי ניתוח סטריליים על הווילונות הסטריליים מבלי לגעת בהם. הרימו את העכבר ומקמו אותו בשדה הראייה. התאימו את התאורה כדי להאיר את האזור.
- יש להסיר מהאריזות שלושה מקלוני חיטוי עור 3.15% כלורהקסידין גלוקונאט ו-70% איזופרופיל אלכוהול ולהניח ליד החיה.
- החליפו לכפפות כירורגיות סטריליות. עבודה בתנועה מעגלית המתחילה במקום החתך, מקלון את בעל החיים עם מקלון כלורהקסידין/אלכוהול חדש שלוש פעמים.
- אתר את אתר החתך כפי שמוצג באיור 1A. צובטים את העור בפינצטה, משתמשים במספריים כדי לבצע חתך לשכבת העור כ -1 ס"מ מעמוד השדרה ומתחת לכלוב הצלעות. לאחר שאורך אתר החיתוך הוא כ-1 ס"מ, יש לבצע אתר חיתוך דומה למטה, בשכבת השריר.
הערה: יש לבצע את החתך באורך הנכון כדי לאפשר לכליה לעבור בקושי דרך החתך ואז להישמר במקומו על ידי החתך עצמו. חתך קטן מדי ולא ניתן לחשוף את הכליה; גדול מדי והכליה תמשיך להחליק חזרה לחלל הבטן.
- אתר את הכליה.
הערה: זה עשוי להיות גלוי בין רקמת שומן לבן. הטחול ממוקם גם בצד שמאל של החיה. הצבע של איברים אלה יכול להיות מובחן חזותית, כמו הטחול הוא חום כהה בעוד הכליה היא אדום כתום כהה. זה לא רצוי לתפעל את הטחול כפי שהוא יכול להיות קרע בקלות.
- בלי לגעת בכליה, חשפו אותה בעדינות מחלל הבטן על-ידי הפעלת לחץ יציב ועדין על הבטן עם האצבעות (איור 2C). השתמש בפינצטה סגורה כדי לדחוף בעדינות איברים לא רצויים בחזרה לתוך הבטן במידת הצורך. אין להשתמש במלקחיים פתוחים, שכן הדבר עלול לפגוע בכליה או באיברים אחרים.
- ברגע שהכליה יוצאת מהבטן, הפרידו אותה בעדינות מהשומן שמסביב בדיוק מספיק כדי לדמיין את אגן הכליה, נקודה לבנה קטנה (איור 1B). דחפו את עודפי השומן לצד אחד או הסירו במידת הצורך. הקפד לא להסיר את בלוטת יותרת הכליה, הממוקם ליד הקוטב העליון של הכליה, או את קפסולת הכליות.
- השתמשו במלקחיים סגורים כדי לדחוף כלפי מטה בצד ימין של הכליה כך שאגן הכליה יישאר בטווח ראייה, אחזו במזרק האינסולין הטעון ביד ימין והחזיקו אותו במקביל למשטח העבודה כשהמחט מכוונת אל אגן הכליה (איור 2E). הכניסו את המחט בזהירות לתוך אגן הכליה של הכליה המשותקת, כפי שמוצג באיור 1B.
- הזריקו את התמיסה במהירות תוך שלוש שניות. כשליש מהכליה עשויה להתנקות ולשנות את צבעה ללבן.
הערה: שכיח לראות הצטברות נוזלים בכמוסת הכליה לאחר הזרקה, כמו גם היווצרות המטומה. נזק מסוים נחוץ כדי להשיג רמה מספקת של טרנספקציה DNA לזיהוי.
- שמור את המחט במקומה במשך כ -10 שניות כדי למנוע זרימה חוזרת של התמיסה. ואז בזהירות ולאט להסיר את המחט. להחזיר את האיבר לחלל הבטן על ידי מתיחה עדינה של אתר החתך ובאמצעות מלקחיים סגורים.
- תפרו את שכבת השריר של החיה עם 5-0 תפרים נספגים, והציבו 2-4 קשרים עצמאיים.
- תפרו את שכבת העור של החיה עם 5-0 או 6-0 תפרי ניילון שאינם נספגים, והציבו 2-4 קשרים עצמאיים.
הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בכלי ניתוח לאחר הנחתם באמבט חרוזים סטרילי ולהתקרר.
