$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. השתלת תאים
כדי להשתיל תאי Renca תוך כלייתית, הכינו תאי Renca לתרחיף חד-תאי בגודל 2 x 106 תאים/מ"ל בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS).
- הסר תאי רנקה דבקים מבקבוק תרבית הרקמה באמצעות 0.25% טריפסין ב- HBSS. לאחר ~5 דקות, מוסיפים סל"ד מלא לבקבוק כדי לנטרל את הטריפסין ומעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה לשטיפה. צנטריפוגה את התאים בכוח G צנטריפוגלי יחסי של 300 (RCF x g) למשך 5 דקות ב-25°C.
- דקנט את הסופרנאטנט והשהה מחדש את התאים ב- HBSS. ספור את התאים באמצעות hemocytometer וכוונן את עוצמת הקול עם HBSS כדי להניב 2 x 106 תאים / מ"ל.
- משוך את התאים לתוך מזרק 1 מ"ל מצויד מחט 18 מד כדי למנוע לחץ גזירה על התאים. החלף את המחט של 18 מד במחט של 28 מד לפני הזרקת תאי הגידול. זריקה של 0.1 מ"ל מספקת 2 x 105 תאים לתוך הכליה.
2. הכנת אזור כירורגי
- הכינו אזור כירורגי סטרילי בארון בטיחות ביולוגית על ידי הנחת וילון כירורגי סטרילי מעל כרית חימום. אספו את כל האספקה, כולל מלקחיים, אזמל, מספריים, טיפות עיניים, חיטוי 5% פובידון-יוד וגזה סטרילית. יש לבצע אוטוקלאבים בכל המכשירים לפני השימוש.
- בצע את הניתוח בטכניקת קצה אספטי. עיקור מכשירים בין בעלי חיים באמצעות מעקר חרוזים. יש ללבוש כפפות סטריליות, מעיל מעבדה ומסכת פנים.
3. הכנת בעלי חיים
- הרדימו את העכברים בקטמין/קסילזין (87.5 מ"ג/ק"ג ו-12.5 מ"ג/ק"ג, בהתאמה, כלומר לפי הנחיות המוסדיים. קבע את עומק ההרדמה על ידי ביצוע צביטת בוהן.
- כאשר בעל החיים נחשב לא מגיב, להכין את אתר ההזרקה (למשל, אגף שמאל) על עכברי Balb/c על ידי מריטה (עם אצבעות) או גילוח (באמצעות קוצץ) את הפרווה.
- העבירו את העכברים מאזור ההכנה לניתוח (למשל, כלוב הדיור) לאזור הניתוח ומרחו משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש. ספוג ליברלי את אתר החתך המוכן עם חיטוי פובידון-יוד 5%.
- הזריקו bupivacaine hydrochloride (0.1 מ"ל של תמיסת 2.5 מ"ג/מ"ל, s.c.) לאזור שבו החתך יבוצע כמשכך כאבים לפני הניתוח.
- בצע חתך יחיד (~ 1.0 עד 1.5 ס"מ) בצד שמאל של החיה באמצעות אזמל סטרילי או מספריים בזהירות כדי לא לחדור את הצפק. מפרידים את הדרמיס מהצפק בעזרת מספריים סטריליים. טפחו את אתר החתך עם גזה כותנה סטרילית כדי להסיר דם.
- החזק את העכבר בשתי ידיו, באמצעות יד שמאל כדי להחזיק את הראש ויד ימין כדי לתמוך באגף.
- זהה את הטחול דרך הצפק, ועם אצבע אחת של יד ימין, משש את העכבר מתחת; הכליה צריכה להיות גלויה כעת דרך הצפק. שמור על אחיזה איתנה של החיה כדי לספק מתח על פני הצפק והכליות.
- בקש מאדם שני להזריק את תאי הגידול (שהוכנו בסעיף 1.2) דרך הצפק השלם למרכז הכליה באמצעות מזרק 1 מ"ל המצויד במחט 28 מד. ספק באיטיות 0.1 מ"ל (2 x 105) תאים. לאחר הזרקת התאים, החזיקו את המחט במקומה למשך 5-10 שניות כדי להפחית את הזרימה האחורית של התאים. חשוב לציין את הצורך בזהירות רבה בשלב זה, שכן האדם המזריק את התאים יביא את המחט קרוב לאצבעותיו של האדם המחזיק את העכבר.
- הסר את המחט וסגור את החתך עם שכבה דקה של דבק רקמת ציאנואקרילט.
- החזירו את בעל החיים לכלוב נקי בעזרת מגבת נייר סטרילית. אפשרו לבעלי החיים להתאושש על כרית חימום. אין להשאיר את בעלי החיים ללא השגחה במהלך תקופת ההחלמה. אין להחזיר את בעלי החיים לתנאי דיור סטנדרטיים עד שהם זקופים וחזה. יש לפעול בהתאם להנחיות המוסדיות בכל הנהלים המשתמשים בחיות מעבדה.